MMP28在胰腺癌PI3K-Akt信号通路中的作用及机制*

李琳，喻超，潘耀振，陈玲，邓路，雷林翰，孙诚谊*

(贵州医科大学附属医院 肝胆外科，贵州医科大学 肝胆胰脾重点实验室，贵州省肝胆胰脾疾病研究所，贵州 贵阳 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是世界上最常见的癌症之一，中位生存期仅3～6个月，5年生存率不到5%[1]。尽管手术技术方法和辅助药物治疗取得了长足的进步，但过去40年中关于PC的预后没有明显改变，死亡率接近发病率[2]。PC的高致死率主要源于其生物学行为，早期转移且缺乏早期发现的标志物等特性都导致PC在发生早期很难被发现[3]，因此发掘早期诊断的标志物对于PC的诊断和治疗至关重要[4]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是能够降解几乎所有类型细胞外基质的酶，它们在生理过程中发挥着广泛的作用，例如癌症进展等[5]。已有研究表明基质金属蛋白酶28(matrix metalloproteinase 28，MMP28)可能参与癌症的发生发展，并且与癌症的转移机制相关[6-7]。磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号转导途径是人类癌症中最常改变的途径之一，在驱动肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用[8-10]。PI3K信号级联反应的过度激活是人类癌症中最常见的反应之一，在细胞内信号转导对细胞外刺激物的响应起关键协调作用[11]，但目前有关MMP28在PC中的作用和机制研究还比较缺乏。本文通过对MMP28进行生物信息学分析，观察可能生物学过程及其通路，并通过实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)和免疫印迹实验(Western blot)实验验证MMP28在PC细胞中的作用与机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株与主要试剂 人PC细胞株PANC-1细胞为中山大学肿瘤防治中心惠赠，胎牛血清(fatal bovine serun，FBS)、胰蛋白酶及培养基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)购自美国Gibco公司，RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL2)、叉头框转录因子1(forkhead box O1，FOXO1)和细胞程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)引物购自上海生工生物工程公司，相应WB一抗购自美国proteintech公司，MMP28转染试剂(包括MMP28对照试剂、MMP28下调试剂及MMP28上调试剂)购自广州锐博生物公司，逆转录试剂盒和SYBR Premix ExTaq试剂盒均购自日本TaKaRa公司。

1.1.2主要仪器 CFX96 Bio-Rad荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司，ChemiDocTMTouch bio-rad化学发光成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1生物信息学分析 利用cBioPortal网站在线分析TCGA数据库(http://www.cbioportal.org/)，选择胰腺导管腺癌数据库PAAD，数据类型选择mRNA表达谱，根据TCGA数据库分析结果，选取与MMP28相关的基因中相关系数较大(Person系数>0.5)的基因进行生物信息学分析。GO富集分析包括与MMP28相关的细胞组成(cellular component，CC)分析、生物过程(biological process，BP)分析及分子功能(molecular function，MF)分析，KEGG富集分析与MMP28相关的通路分析，并通过GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析MMP28与其互作基因之间的关系。

1.2.2细胞培养及分组 PANC-1细胞培养于10%FBS的DMEM培养基、37 ℃的5%CO2恒温恒湿培养箱，将PANC-1细胞消化铺于培养瓶中、105个细胞/瓶；铺板6 h后，将细胞分为MMP28对照组(NC组，给与MMP28对照试剂)、MMP28下调组(si-MMP28组，给与MMP28下调试剂)及MMP28上调组(U-MMP28组，给与MMP28上调试剂)，待48 h后取细胞进行其他实验。

1.2.3qPCR检测BCL2、FOXO1及PDCD4 mRNA的表达 选择各组处于对数生长期的PANC-1细胞，提取总RNA，依照逆转录试剂盒的说明分别将样品逆转录为cDNA，再选择GAPDH作为内参，使用SYBR Premix ExTaq试剂盒进行qPCR实验以检测BCL2、FOXO1及PDCD4 mRNA的表达。

1.2.4Western blot检测Akt和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylase protein kinase B，p-Akt)的蛋白表达 选择各组处于对数生长期的PANC-1细胞，提取细胞总蛋白，根据蛋白定量结果进行电泳、转膜、封闭、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜及曝光，用Image Lab软件分析所得条带的灰度值，检测Akt和p-Akt的蛋白表达量。

1.3统计学分析

2 结果

2.1MMP28的生物学功能

根据TCGA数据库分析结果选取与MMP28相关的基因中相关系数较大(P>0.5)的基因进行GO富集分析，CC结果显示MMP28与细胞外泌体、膜转运及细胞黏附功能相关(图1A)；BP结果显示MMP28可能与细胞黏附、细胞与细胞间黏附及表皮发生发展相关(图1B)；MF结果显示MMP28可能与Ca2+结合及结构分子活性相关(图1C)。

2.2MMP28的信号通路

根据TCGA数据库分析结果，选取与MMP28相关的信号通路中相关性前10的信号通路进行分析，结果显示MMP28可能参与多种和癌症发生发展相关的信号通路，包括黏着斑信号通路和PI3K-Akt信号通路。见图2。

注：A为与MMP28相关的细胞组分图，B为与MMP28相关的分子功能图，C为与MMP28相关的生物学过程图。

图2 生物信息学分析MMP28的信号通路

2.3MMP28对PI3K-Akt信号通路的影响

通过GEPIA网站分析结果显示，MMP28与BCL2、FOXO1及PDCD4等信号分子呈负相关关系(图3A、3B及3C)；qPCR结果表明，与NC组相比，si-MMP28组PANC-1细胞的BCL2、FOXO1及PDCD4 mRNA表达水平上调，U-MMP28组PANC-1细胞BCL2、FOXO1及PDCD4表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05，图3D)。

注：A、B、C分别为MMP28与BCL2、FOXO1、PDCD4表达的关系，D为3种基因表达的直条图；(1)与NC组比较，P<0.05。

2.4MMP28对PI3K-Akt信号通路活性的影响

与NC组比较，si-MMP28组PANC-1细胞的p-Akt蛋白表达水平上调，U-MMP28组PANC-1细胞的p-Akt蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：(1)与NC组比较，P<0.05。

3 讨论

PC因其极高的病死率一直是医学研究攻克的一个难点，无论是早期诊断、治疗，提高患者的生存时间和生存质量都是学者们持续研究的目标[12-14]。目前已有大量研究探索PC的发生机制并力图找到可应用的靶点[15-16]。本研究为了探索MMP28在PC中的作用机制，首先通过富集分析MMP28在PC中可能有关的细胞成分、生物学过程和分子功能，分析结果可以看出MMP28与膜转运相关；与细胞黏附功能也相关；与结构分子活性相关，经过系统分析表明MMP28应参与PC的侵袭转移过程。通过对MMP28的进一步分析，发现已有研究表明MMP28可作为胃癌侵袭转移的独立预后标志物[6]。进一步富集分析发现MMP28可能参与的信号转导通路，发现MMP28可能参与与PI3K-Akt转导通路。PI3K-Akt转导通路是在癌症发生发展过程中极其重要的一个通路[17-19]。Wei等[20]通过研究表明可以部分通过PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路调节PI3K的活性以促进自噬并抑制上皮间质转化。Yang等[21]研究发现用4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基异硫氰酸酯处理的肺癌细胞表现出对PI3K-Akt信号通路的显著抑制；Wang等[22]发现SOX9/miR-203a轴对PI3K/Akt途径的激活作用及其在癌症中的作用。这些都表明PI3K-Akt信号通路是癌症的发生发展过程中及其重要的信号转导通路。

为探索MMP28是否参与PI3K/Akt信号转导通路，首先在GEPIA网站中搜索MMP28与之相关的PI3K信号通路上的信号分子，结果显示MMP28与BCL2、FOXO1及PDCD4等信号分子呈负相关关系，而BCL2、FOXO1及PDCD4都参与PI3K-Akt信号转导通路[23-26]。进而通过检测3组PANC-1细胞中的BCL2、FOXO1及PDCD4表达情况，发现与前面分析的结果相同，MMP28与BCL2、FOXO1及PDCD4等信号分子呈负相关关系。为进一步验证MMP28参与PI3K-Akt信号转导通路，通过WB来验证Akt和p-Akt在不同分组中的表达情况，结果表明3组PANC-1细胞Akt的蛋白表达基本相同，p-Akt的蛋白表达则不同。与NC组相比，U-MMP28组PANC-1细胞p-Akt的表达减少，si-MMP28组PANC-1细胞p-Akt的表达增加，这表明MMP28与Akt的激活相关，参与PI3K-Akt信号转导通路，也表明了MMP28可能与癌症的增殖、分化及凋亡等相关。

综上所述，本研究通过生物信息学分析并结合相关实验表明MMP28在PC细胞相关肿瘤信号通路PI3K-Akt信号通路的激活过程中发挥重要作用，MMP28通过调控该通路中Akt的磷酸化水平，进而调控下游靶基因的表达，但是相关机制还有待进一步研究。