黑果枸杞多糖对大鼠肝损伤的保护研究

(南昌大学科学技术学院,江西南昌 330029)

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)是由富含淀粉类的食物和天冬酰胺在高温下进行化学反应生成的一种有毒副产物,是热加工食品中重要的内源性污染物之一,进入人体的AA约有90%会被代谢,仅少部分(<10%)会以原形从尿中排出[1],AA毒性在有机体的累积会诱导产生氧化应激反应与肝损伤现象,姜丽平等[2]研究发现,高浓度的丙烯酰胺毒性累积会增加细胞内的活性氧(ROS)的水平,ROS对蛋白质、细胞膜脂质的连续攻击所造成的相关靶分子累计氧化损伤,会造成细胞代谢紊乱和功能异常,引起肝组织损伤现象。

黑果枸杞(学名:LyciumruthenicumMurr.)为茄科、枸杞属,主要分布于中国陕西北部、宁夏、甘肃等地,成熟干燥时食用。黑枸杞含有多种氨基酸、多糖、黄酮类化合物等。枸杞多糖是黑枸杞的有效药物成分,其多糖含量为9.92%[3]。黑果枸杞中酸性多糖的含量高于红果枸杞,中性多糖含量无显著性差异,两种枸杞中多糖结构基本相似[4]。黑枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)作为一种天然的抗氧化剂具有增强肝脏抗氧化、抑制炎症反应、清除自由基等抗氧化功能[5-6]。据文献报道天然的食品抗氧化剂可以有效消弱AA在机体内的毒性效果,有良好的调节保护作用。赵岩[7]通过实验研究发现枸杞多糖能降低糖尿病大鼠早期肾脏系数和血清尿素氮、肌酐水平,升高血清及肾组织 SOD、CAT、GSH-Px活性和降低丙二醛(MDA)水平;贾东升等[8]研究发现LBP能提高肝纤维化大鼠肝脏中SOD、GSH-Px和GSH的活性,并显著降低MDA的含量。曹军等[9]研究证实姜黄素能明显抑制丙烯酰胺毒性引起的细胞ROS水平升高;陈冬妍等[10]研究表明大蒜素对丙烯酰胺和环氧丙烯酰胺毒性导致的组织和细胞氧化损伤具有较强的保护作用;Zhao等[11]研究证实蓝莓花青素可通过防止氧化应激的反应来提供对抗丙烯酰胺毒性诱导的线粒体损伤。黑枸杞多糖是天然的抗氧化资源之一,本研究旨在探索黑枸杞多糖对AA致大鼠肝损伤,为在食品中作为防护AA毒性第二道屏障的膳食补充剂提供一种新的天然抗氧化剂来源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级大鼠(Sprague Dawley SD) 70只,体质量(180±10) g,6周龄,雌雄各半,由南昌大学医学院实验动物中心提供,实验动物许可证号:SYXK(赣)2015-0003;黑果枸杞 产自甘肃定西,经鉴定为茄科植物黑果枸杞的成熟干燥果实;黑枸杞多糖 由本实验室提取纯化,经鉴定为黑枸杞多糖,纯度为99%;MDA、CAT、SOD、GSH-Px试剂盒 碧云天生物技术研究所;AST、ALT试剂盒 南京建成生物工程研究所;葡萄糖标准品(纯度≥99%) 上海楷岳生物科技有限公司。

GT10-1型高速台式离心机 广东佛衡仪器有限公司公司;EU-2800DS紫外可见光分光光度计 上海昂拉仪器有限公司;Thermo多功能酶标仪 山东博科科学仪器公司;SZ-93双蒸水仪 上海亚荣生化仪器厂;N-110-D型旋转蒸发仪 巩义市瑞德仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑枸杞多糖的制备 取黑枸杞干燥粉末5.0 g,80%乙醇前处理,按照提取温度为90 ℃,液料比为30∶1,取时间为2 h,水提液浓缩后,加入氯仿/正丁醇=5∶1试剂,充分震荡离心6次,95%乙醇溶液搅拌,冷藏过夜,离心,70%乙醇洗涤,减压干燥得黑枸杞多糖[12-14]。

1.2.2 动物分组和给药 健康成年大鼠70只,体质量(180±10) g,在12 h明暗循环动物饲养房内适应性生活一周。将大鼠随机分为7组,每组10只,雌雄各半,正常进食饮水条件下进行灌胃给药:AA染毒模型组(AA,灌胃AA水溶液20 mg/kg bw)、阳性对照组(NAC+AA,灌胃NAC水溶液200 mg/kg bw)、毒性抑制组(黑枸杞多糖低、中、高剂量组,分别灌胃黑枸杞多糖50 mg/kg bw(LBPL+AA)、100 mg/kg bw(LBPM+AA)、150 mg/kg bw(LBPH+AA))、高剂量多糖组(LBPH,灌胃黑枸杞多糖200 mg/kg bw)、正常对照组(CT,给予同等体积生理盐水),前五组每天灌胃丙烯酰胺水溶液半小时后,所有组别大鼠给予相对应的药物,连续给药饲喂4周。实验前和实验中每周对大鼠进行称重,记录给药期间大鼠体重的变化,结束给药后进行各类相关指标测定。

1.2.3 大鼠肝组织中氧化指标的测定 末次给药后1 h后,每组随机取5只大鼠,颈椎脱臼处死,迅速取其肝脏置于冰浴上,剔除结缔组织,取0.5 g加预冷的生理盐水研磨,制成10%的组织匀浆液,4 ℃、4000 r/min离心15 min,取其上清液备用。按试剂盒说明书,测定大鼠肝脏中 MDA、CAT、SOD 和 GSH-Px的活力。

1.2.4 大鼠血清中肝损伤指标的测定 末次灌胃给药24 h 后,每组随机取5只大鼠,摘除眼球取血,室温待血清分层后,4 ℃、4000 r/min离心,取上层血清,4 ℃备用。参照试剂盒说明书,检定大鼠血清中 ALT、AST 水平。

1.2.5 大鼠肝脏组织形态检测 末次给药后24 h后,每组随机取5只大鼠,颈椎脱臼处死,迅速取出肝脏,在距肝大叶边缘处横切5 mm×5 mm×5 mm块状肝组织,生理盐水冲洗后,波恩固定液中固定,梯度酒精脱水、透蜡、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色,制作成病理切片,显微镜观察肝脏组织形态结构。

1.3 数据处理

2 结果分析

2.1 丙烯酰胺毒性对大鼠生长的影响

AA连续染毒4周后,与CT组相比较,AA染毒组大鼠精神明显变差,进食、活动量明显减少;摄入不同剂量LBP及NAC各组大鼠的活动量、进食量得到不同程度的改善。AA染毒各时期大鼠体重变化见表1:染毒7～28 d,与CT组比较AA染毒组体重均显著降低(P<0.05);染毒21、28 d后,与AA染毒组相比较,摄入不同浓度的LBP实验组与NAC阳性对照组大鼠体重都得到显著改善(P<0.05);与正常对照组相比较,LBPH组体重没有表现出明显差异。说明黑枸杞多糖对大鼠体重无副作用,且对丙烯酰胺造成机体体重损失起到明显的缓解效果。

表1 各组大鼠体重变化(n=10,g)Table 1 The changes for rats body weight(n=10,g)

2.2 大鼠肝组织中氧化指标的测定结果

黑枸杞多糖对AA致大鼠肝组织中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性的影响如表2所示。与CT组相比,AA组大鼠肝组织细胞内抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活力均呈显著性降低(P<0.05);与AA染毒组相比较,LBP+AA各组和NAC+AA组细胞中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活力均有显著性提高(P<0.05),尤其是LBPM+AA组对肝细胞中抗氧化酶GSH-Px活力的提高效果优于NAC+AA组;LBPH单独处理组细胞中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px与CT组相比较,数据没有明显的差异,这说明黑枸杞多糖单独处理时,对机体的抗氧化防御系统无损伤,对机体无毒害作用,且黑枸杞多糖能改善AA所致的肝损伤。

黑枸杞多糖对AA致大鼠肝组织中抗氧化酶MDA活性的影响如表2所示:与CT组相比较,AA染毒组中过氧化物MDA含量显著增高(P<0.05),与AA组相比较,NAC+AA组和LBP+AA各组肝组织中MDA均显著性降低(P<0.05)。这说明不同浓度的黑枸杞多糖均能够降低机体内MDA的含量,并且随着黑枸杞多糖浓度的升高,机体内MDA含量逐渐降低,具有浓度依赖性。

表2 黑枸杞多糖对肝损伤大鼠组织中氧化指标的影响(n=10,g)Table 2 Effects of LBP on biochemical parameters in hepatic damage rat(n=10,g)

2.3 大鼠肝损伤指标的测定结果

黑枸杞多糖对AA致大鼠肝损伤指标如表3数据所示,与CT组相比较,AA组肝组织中AST、ALT的含量表现出显著性升高(P<0.05),说明灌胃AA可引起大鼠肝细胞损伤;与AA染毒模型组相比较,NAC+AA组和LBP+AA保护组各组AST、ALT含量均显著降低(P<0.05);在黑枸杞多糖组中,尤其以100 mg/kg多糖组对肝组织的AST、ALT含量的降低效果显著,显著优于阳性对照组(P<0.05);与CT组相比较,LBPH组肝细胞中ALT的含量无明显差异。表明不同浓度黑枸杞多糖对丙烯酰胺造成机体AST、ALT含量的升高具有明显的减弱作用。

表3 黑枸杞多糖对大鼠肝损伤指标的影响(n=10,g)Table 3 Effects of LBP on rat in hepatic damage(n=10,g)

2.4 大鼠肝组织病理学形态观察

黑枸杞多糖对AA致大鼠肝组织损伤见图1,CT组大鼠肝组织形态正常,肝小叶结构完整,无细胞破裂、自溶或坏死等现象。与CT组相比,AA染毒组肝组织出现严重病变,炎细胞浸润现象严重,肝小叶排列紊乱,肝细胞肿胀严重,出现成片坏死现象,胞浆稀松,肝细胞之间边缘界限模糊;与AA染毒组病理图片相比,NAC+AA组和LP+AA各组肝组织病变情况得到很好的改善,各组肝细胞没有明显的病例症状,肝细胞排列正常,细胞边缘界限清楚,细胞结构完整。

图1 黑枸杞多糖对AA致肝损伤的大鼠肝组织形态学变化的影响(100×)Fig.1 Effects of LBP on liver histological changes of AA induced in rats(100×)注:A.CT组;B. AA组;C. NAC+AA组;D. LBPL+AA组;E. LBPM+AA组;F. LBPH+AA组;G. LBPH组。部分肝细胞肿胀,炎症细胞浸润(椭圆),胶原纤维形成(箭头)。

3 讨论

大量研究表明[15-18],肝脏具有较强的抗氧化防御机制,各种抗氧化酶:如SOD1、Catalase 1、谷胱甘肽过氧化酶(GPX)和维生素C、E,以及谷胱甘肽等,脂质氧化产物与肝脏疾病存在一定的联系。在机体防御系统中,抗氧化酶CAT、SOD的高低可以反映该组织中超氧阴离子的清除能力,GSH-Px可以清除由活性氧(ROS)引起的脂质过氧化物酶,保护细胞膜功能和结构的完整性[19],而MDA的含量增加或减少可以直接反映过氧化的程度或者间接反映氧化应激所导致的损伤程度[20]。有研究结果显示[21],高剂量黑果枸的补充可有效降低谷丙转氨酶,提高机体SOD含量,从而对大鼠运动性心肌损伤引起的心肌脂质过氧化起到阻止作用。汪建红等[22]研究发现,黑枸杞多糖可以增强糖尿病小鼠血清和肝脏SOD活性,降低其血清和肝脏MDA含量,并能促进葡萄糖转变为肝糖原。本研究的结果显示:摄入黑枸杞多糖可以有效减少过氧化MDA的含量,说明机体脂质过氧化得到了控制,这与汪建红的研究结果一致;同时组织中GSH-Px、SOD、CAT的含量也有不同程度的提高,这与于月媛[23]研究结果一致,说明黑枸杞多糖可以提高机体在氧化应激中的总抗氧化能力,由此可推测出,黑枸杞多糖对丙烯酰胺诱导的大鼠肝损伤的保护机制与其抗氧化性有关。

AA诱导的肝损伤大鼠血清中ALT、AST活性显著高于空白组,LBP+AA各组均能显著降低AA诱导的大鼠血清中转氨酶的含量,其中高剂量组LBP比低剂量组效果更好;肝组织病理切片形态学结果进一步证实了LBP对AA致大鼠肝损伤的缓解作用,LBP+AA各组组织切片中,肝细胞的肿胀、变形明显减轻,炎症得到有效控制,肝小叶的排列,细胞之间的界限模糊都得到了有效控制,表明黑枸杞多糖能有效缓解AA诱导的大鼠肝损伤。一定浓度的AA毒性累积会导致细胞内ROS的增加,ROS对蛋白质和细胞膜脂质与DNA的连续性攻击,会导致肝细胞膜受损,ALT、AST主要分布于肝细胞胞浆内,肝细胞受损后,细胞膜通透性增加,血清中ALT、AST的浓度会显著升高,因此血清中ALT、AST的含量变化是肝组织受损程度的重要指标[24]。AA染毒后,肝组织出现严重病变,肝小叶排列紊乱,肝细胞之间边缘变得模糊,细胞膜受损,肝细胞肿胀、破裂、自溶,严重的甚至出现成片坏死现象[25]。LBP干预后,肝组织损伤得到缓解,其中以LBPH+AA组最接近CT组。表明高浓度LBP对缓解肝损伤具有积极作用。

综上,LBP对大鼠肝损伤具有一定的保护作用,通过调节细胞膜通透性,降低组织细胞中氧化水平,清除机体自由基,从而增强机体对高温加工食物中AA损伤的耐受性。