电喷雾-离子迁移谱快速检测减肥类保健食品中非法添加的22种化学药物

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(1.江苏省食品药品监督检验研究院,江苏南京 210019;2.南京中医药大学药学院,江苏南京 210023)

随着国民生活水平的提高、人们饮食结构的改变,超重和肥胖的发病率逐日上升。由肥胖导致的糖尿病、睡眠呼吸暂停综合症、脂肪肝、抑郁症、心脑血管疾病等临床现象愈发普遍[1]。目前WHO认为肥胖是威胁人类健康的十大疾病之一[2]。一些非法商家利用部分患者减肥心切和讳疾忌医的心理,在减肥类保健食品中非法添加某些化学药品以达迅速疗效。目前市面上减肥类保健食品中常见的非法添加物有多类[3]:食欲抑制剂(西布曲明、芬氟拉明)、能量消耗剂(麻黄碱、咖啡因)、利尿剂(呋塞米、氢氯噻嗪)、抗抑郁剂(氟西汀、安非他酮)等化学药物,长期服用可能会产生药物依赖性,甚至损害器官、危害健康[4]。

目前大量文献报道了检测保健食品中非法添加的违禁化学药物的仪器检测方法,包括毛细管电泳法[5]、薄层色谱与拉曼光谱法[6]、高效液相色谱法[7]、气相色谱-质谱法[8]、高效液相色谱-串联质谱法[9]等。这些检测方法专属性和准确性较高,但存在前处理操作繁琐,对环境、设备、操作人员要求较高等问题,均不适用于保健食品非法添加的现场快速筛查,造成监督检验的时效性不高、支撑力不够的局面[10]。

离子迁移谱(IMS)是上世纪70年代初发展起来的一种微量化学物质分析检测技术,它是基于气相中不同的气相离子在电场中迁移速度的差异来对化学离子物质进行表征,作为快捷便利的分析手段,IMS具有小型化、易携带、操作简便、响应迅速等优点[13-14],在痕量检测中的优势极为突出,分析时间为S级。随着快检车的出现,可以作为车载仪器手段加以推广。目前,IMS已在毒品[15]、爆炸物[16]、药品滥用[17]等方面得到广泛应用。它可作为快筛方法用于市场监督,已有文献报道可应用于壮阳类保健食品中非法添加的5型磷酸二酯酶抑制剂[18];改善睡眠类保健品中非法添加的巴比妥类药物[19];抗风湿类中成药中添加的非甾体抗炎药[20]等。

IMS有固、液、气多种进样方式,何欢等[21]以63Ni作为电离源,用溶液点于试纸直接进样的方式对减肥类保健食品进行了非法添加的筛查。本文利用电喷雾-离子迁移谱(ESI-IMS)法,对减肥类保健食品中常见的22种非法添加药物进行分析,建立了减肥类保健食品中非法添加的现场快速筛查方法,并对40批减肥类保健食品样品进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

40批保健食品标示具有减肥类功效 均为市售;甲醇 HPLC级,美国Fisher公司;乙酸 HPLC级,美国Sigma Aldrich公司;氨水 HPLC级,Aladdin公司;色氨酸(纯度99.9%)、柠檬酸(纯度97.0%)、普罗布考(纯度100.0%)、盐酸芬氟拉明(纯度99.9%)、盐酸安非他酮(纯度99.9%)、盐酸吡格列酮(纯度100.0%)、瑞格列奈(纯度99.8%)、吉非罗齐(纯度99.8%)、盐酸西布曲明(纯度99.9%)、盐酸N-单去甲基西布曲明(纯度94.4%)、盐酸N,N-双去甲基西布曲明(纯度94.4%)、盐酸氟西汀(纯度99.3%)、马来酸罗格列酮(纯度99.5%)、盐酸伪麻黄碱(纯度99.8%)、盐酸甲基安非他明(纯度99.9%)、非诺贝特(纯度99.9%)、吲达帕胺(纯度97.7%)、比沙可啶(纯度100.0%)、盐酸二甲双胍(纯度100.0%)、酚酞(纯度99.8%)、呋塞米(纯度99.3%)、氢氯噻嗪(纯度99.7%)、氯噻嗪(纯度100.0%)、氟伐他汀钠(纯度95.5%) 以上标准品均购自中国食品药品检定研究院。

GA2100离子迁移谱仪 Excellims公司;AG-1620型空气发生器 北京科普生分析科技有限公司;XP6型微量电子天平 瑞士Mettler Toledo公司;十万分之一天平 德国Satorius公司;超纯水系统 美国Millipore 公司;Branson 8510超声清洗仪 美国Branson公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 标准品溶液 称取标准品各2.5 mg,分别置于25 mL量瓶中,用80%甲醇溶液溶解至刻度,配制成100 μg·mL-1的标准品储备液。再用含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液稀释至10 μg·mL-1,作为标准品溶液I;用含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀释至10 μg·mL-1,作为标准品溶液Ⅱ。

1.2.1.2 样品前处理 分别称取减肥类保健食品(胶囊取其内容物,茶剂、片剂和丸剂研磨后取其粉末)0.5 g研细后置于20 mL量瓶中,用80%甲醇溶液超声提取10 min,静置,取其上清液过0.45 μm微孔滤膜,即得供试品储备液。量取供试品储备液5.00 mL,置10 mL具塞玻璃比色管,用含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液稀释至刻度混匀,即得正离子测定样品储备液;量取供试品储备液5.00 mL,置10 mL具塞玻璃比色管,用含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀释至刻度混匀,即得负离子测定样品储备液。

Research on developmental and motional characteristics of Daaoxi unstable rock along

正离子/负离子测定样品溶液:取正离子/负离子测定样品储备液0.200、0.500、1.00 mL置10 mL具塞玻璃比色管中,用含0.5%乙酸(V/V)/0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀释至刻度,即得稀释50倍、25倍、10倍的样品溶液。

1.2.2 IMS仪器参数

1.2.2.1 仪器校正 进样前用内径为1.46 mm的注射器取校正溶液对仪器进行校正(色氨酸校正时间为10.210 ms;柠檬酸校正时间为8.606 ms)。校正完后取待测溶液适量(30～50 μL)进样分析。

1.2.2.2 IMS 检测条件 正离子模式下源电压2200 V;负离子模式下源电压1800 V。两种模式下,进气口温度均为180 ℃;迁移管电压8000 V,迁移管温度180 ℃;离子栅门电压45 V,脉冲宽度120 μs;进样速度1.2 μL·min-1。

1.3 数据处理

以迁移时间(ms)为横坐标,强度为纵坐标绘制离子迁移谱图谱,记录各化合物迁移峰的迁移时间和强度。

2 结果与分析

2.1 条件的选择和优化

2.1.1 IMS条件的选择和优化 比较了源电压(1600～2600 V)对测定结果的影响。结果表明,改变源电压,迁移时间不会发生改变,但会影响物质的相对响应。22种化合物响应值随源电压变化的关系如图1(图1a为负离子模式;图1b～1d为正离子模式)所示。综合考虑,正离子模式下选取2200 V作为源电压,负离子模式下选取1800 V作为源电压。同时也对迁移管电压(7500～8500 V)、门电压、门宽度等参数进行了探究,发现当迁移管电压为8000 V时峰型和分离度最好;改变门电压和门宽度时,结果变化不明显。

图1 不同源电压对目标物响应值的影响Fig.1 The effect of response values of 22 kinds of compounds at different source voltages注:a为负离子模式;b～d为正离子模式。

2.1.2 检测模式和迁移时间 在上述优化条件下,将1.2.1.1中标准品溶液I、Ⅱ进行了正负离子模式测验,结果表明,18种物质在正离子模式下有响应,4种物质在负离子模式下有响应,各物质谱图见图2。迁移时间和约化迁移率K0(cm2·V-1·s-1)结果见表1。K0可根据如下公式[15]算出。根据公式,当仪器工作参数一定时,约化迁移率K0只与迁移时间td有关。

表1 22种化合物的IMS特性(n=5)Table 1 IMS characteristics of 22 compounds(n=5)

图2 22种标准品溶液的IMS图谱Fig.2 IMS spectrograms of 22 standard solutions

其中:L(cm)为迁移管长度;P(inHg)为迁移管压强;td(s)为迁移时间;U(V)表示迁移管电压;Td(K)表示迁移管温度。

2.1.3 提取溶剂的选择和优化 根据IMS原理,溶液中水和有机溶剂的比例会影响溶剂蒸发效率和电喷雾离子带电效率,进而影响物质响应。因此,本研究比较了各目标化合物在不同比例甲醇溶液(60%、70%、80%、90%、100%)中的响应情况。结果显示,在80%的甲醇溶液中基线较平,响应较高,因此选用80%甲醇溶液作为提取溶剂。

在正离子模式下,比较了待测溶剂加酸和不加酸的测定结果,结果发现在溶剂中加入适量酸会提高响应值,负离子模式加适量氨水可以提高响应;通过比较甲酸和乙酸,以及0.2%、0.5%、1%、2%的不同酸/碱浓度,可以看出加乙酸比加甲酸基线稍平、响应略好。在加入0.5%的乙酸(ESI+)和0.5%的氨水(ESI-)情况下,目标物的响应最佳。因此,最终确定正离子模式下制备溶剂为含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液;负离子模式下制备溶剂为含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液。

2.2 样品稀释方法的选择

一方面,由于非法添加的化合物往往具有较高浓度,且离子迁移管有一定的记忆效应[13],实验发现长时间使用,仪器响应会降低,需要拆机清洗,故本试验选用将样品储备液稀释不同倍数,从低浓度样品开始采集数据;另一方面,由于减肥类保健食品常见为减肥胶囊、减肥茶,辅料较多,易存在一定的基质效应,为了预防假阴性的产生,选择将样品储备液稀释50、25、10倍,较文献[13]稀释得少。这样既能减小记忆效应,预防离子源的污染,又兼顾灵敏度。

2.3 专属性考察

选取该实验40批减肥类保健食品中,用液相色谱法未检出非法添加的37批阴性样品,进行IMS分析,未发现在22个减肥类药物出峰的位置出现干扰峰;3批阳性样品均检出相应的非法添加物,表明方法专属性良好。

2.4 基质效应和灵敏度的考察

由于保健食品基质的存在,基质中存在的离子未经过色谱分离直接进入离子迁移谱的电喷雾离子源易出现基质效应[22]。实验发现,样品基质对离子迁移谱测定22种减肥类化合物的干扰主要为基质抑制效应,且不同化合物在不同基质中差异较大。以盐酸西布曲明(正离子模式)和呋塞米(负离子模式)为例,胶囊、茶剂、片剂阴性样品各选一批,按照1.2.1.2制备稀释10、25、50倍的样品溶液,进行基质加标,西布曲明的峰高强度约为标准品溶液的75%～105%,而呋塞米约为20%～70%,而峰宽和迁移时间的SD值与对照品没有显著性差异。

故检出限的判定使用基质加标法,选择胶囊、茶剂、片剂阴性样品各一批,按照1.2.1.2的前处理方法操作,得到空白基质溶液(样品储备液稀释50倍)。吸取一定量1.2.1.1的各标准品溶液,用空白基质溶液对该液逐级稀释,以信噪比(S/N)为3时的检出浓度作为检出限(LOD),选择检出限最差的结果作为该物质的检出限,见表1。

由于盐酸甲基安非他明和盐酸二甲双胍的迁移时间与样品溶剂峰迁移时间较接近,因此在少量浓度时,目标化合物的峰会混于样品溶剂峰里不易区分;只有当目标化合物达到一定浓度,其峰的响应值大于溶剂峰响应值时,才会于溶剂峰中凸显出来(图3),因此原本在单一对照中响应较好的安非他明和二甲双胍在基质匹配溶液中检出限都略高,均为1.5 mg/L;负离子模式下的呋塞米、氢氯噻嗪、氯噻嗪、氟伐他汀钠由于基质抑制效应较强,所以检出限浓度也较大,呋塞米检出限为8 mg/L,氢氯噻嗪为3 mg/L,氯噻嗪、氟伐他汀钠为5 mg/L。但由于实际样品中非法添加含量一般较高,甚至可达g/L,因此该类物质的检出限足以能判断是否有非法添加物。

图3 样品基质中二甲双胍(a)和甲基安非他明(b)检出限测定的IMS图Fig.3 IMS image of detection limit of metformin and methamphetamine in sample matrix

2.5 实际样品的测定和谱库的建立

仪器软件自带谱库建立和检索功能,可以在谱库中添加化合物名称和校正后的离子迁移谱信息并保存,直接用于同种型号、同种测定条件下不同仪器之间的数据比较,实现数据共享,特别适合用于进行现场非法添加物质的筛查。

取1.2.1.2中配制的不同稀释倍数的样品溶液,按稀释倍数50、25、10倍的顺序分别在正负离子模式下测定。结果发现,有3批样品除溶剂峰外,稀释50倍即有明显的非法添加峰:正离子模式下有1批(胶囊1)在12.205 ms处检测出非法添加物,与已建谱库核对,疑似非法添加物为西布曲明或吉非罗齐;正离子模式下有1批(胶囊2)在12.360 ms处检测出非法添加物,与已建谱库核对,疑似非法添加物为酚酞;正离子模式下有1批(胶囊3)在12.744 ms处检测出非法添加物,与已建谱库核对,疑似非法添加物为氟西汀。采用实验室已建立的HPLC-IT-TOF法的测定上述样品,结果胶囊2和胶囊3确检出酚酞和氟西汀,如图4所示;而胶囊1除了检出盐酸西布曲明,与离子迁移谱测定结果一致以外,还有少量的酚酞,初筛(稀释50倍)被忽略了。重新同时测定稀释50、25、10倍的样品溶液,如图5所示,依然不能判断出含有酚酞,可能是由于2种物质峰位接近,盐酸西布曲明的比酚酞量大且灵敏度高,淹没了酚酞的信号。其余37批样品未检出与文中所列标准品一致的色谱峰,与离子迁移谱测定结果一致。

图4 胶囊2和胶囊3的IMS图(正离子模式)Fig.4 IMS diagram of capsule 2 and 3(positive ion mode)

图5 胶囊1的IMS图(正离子模式)Fig.5 IMS diagram of capsule 1(positive ion mode)

3 讨论与结论

保健食品中非法添加现象屡禁不止,而以非法添加为目的的专项抽查需要有针对性,以免浪费实验室资源,本研究针对22种减肥类非法添加物质,建立了一种快速、高效的电喷雾-离子迁移谱检测方法,目的在于现场抽样时的快速筛查。相比于体积庞大、操作繁琐,受限于实验室操作的LC-MS等常用分析设备,以及化学试剂盒种类繁多,结果时效性短,判断误差大,建立的离子迁移谱法操作简单、检测时间短。在实际样品测定时,只需对待测样品进行简单的溶剂提取,即可在1 min内完成检测;在数据分析时,可直接利用已建谱库进行非法添加物的筛查,不必再配备标准品进行对照,结果较现有的化学试剂盒、薄层色谱法等现场筛查法更快速,通用性、稳定性和耐用性更好。尽管离子迁移谱有许多优点,但也存有不足之处。首先,离子迁移谱主要是靠迁移时间来对化合物进行定性,在准确定量方面必然不能与目前标准的LC-MS方法相比;其次,定性参数迁移时间的分析窗口较窄,当一些同种类非法添加物迁移时间太过接近时会不易区分;再次,样品基质中有些难以判断的基质干扰峰,可能出现假阳性。但是,现场初筛并不是最终判定手段,尽可能避免假阴性,允许一定假阳性的出现,虽然减肥类保健食品基质繁多,但是某个迁移峰明显,即说明某些物质物质含量很高,且有与谱库相符的异常峰出现,无论添加物为A或B,即可初步判定该样品为问题样品,抽样后待实验室进一步确证。因此,离子迁移谱作为初筛工具,其更适用于现场快速筛查,可大大缩短现场检测时间、提高效率,为监管决策部门提供技术保障和执法依据。