弱磁场对胰蛋白酶活性和构象的影响

,2,*,2

(1.浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022;2.浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室,浙江舟山 316000)

近年来现有的抗生素对于耐药的“超级细菌”的控制已经越发困难。因此,迫切需要开发新型抗菌剂[1]。生物活性肽通常是含有2～20个氨基酸残基的特定的蛋白质片段[2],具有如抗菌、抗氧化等生理功能同时，还可以被人体很好地吸收和利用。因此,生物活性小肽可以筛选药物以及作为功能性食品的主要原料[3],其中海洋生物源抗菌肽因其优越的营养功能和广泛的生物学活性,被认为是最优质的抗菌肽类型之一[4]。

酶解法因其成本低,反应进程易控制等优点成为了处理鱼类肌肉和加工副产物生产抗菌肽的一种重要方法。但酶解法对于大多数抗菌肽来说较为剧烈,抗菌肽的抗菌活性很容易在酶解过程中遭到破坏[5]。因此,较多研究集中于优化抗菌肽生产过程中的酶源、温度、pH和酶/底物比例,然而所获得的抗菌肽的活性仍有待提高[6-8]。

弱磁场在改变酶催化活性的同时对酶的构象也会产生影响,而蛋白质微小的构象改变对其生物功能也会造成很大的影响[13]。肖祖峰等[14]认为电磁场可降低传质过程的活化能,强化扩散。薛丽萍等[15]利用极低频交变磁场处理过氧化氢酶时,发现不同处理温度、磁场强度和频率及酶液pH都会影响酶的二级结构。

胰蛋白酶具有一定的专一性,但是该专一性是相对的,该酶对多种类型的肽键都可以水解。胰蛋白酶的这种相对专一性为水解复杂蛋白质成小分子抗菌肽提供了可能。由于胰蛋白酶的活性中心含有决定其功能的Zn2+,在受到外加磁场的作用后,因为洛伦兹力的影响就有可能改变酶活性[16]。同时,酶分子多肽链具有一定的刚性结构,但其侧链是通过单键与主链相连,故具有相当大的柔性和一定的自由运动能力[17],因此酶分子侧链在磁场作用下会受到较大的扰动,取向分布发生变化,从而导致构象改变[18-19]。

课题组在前期研究中采用不同强度(50、100、150 mT)的弱磁场处理胰蛋白酶后,发现100 mT磁场处理后的胰蛋白酶水解梅鱼获得的酶解液抑菌效果显著高于其他磁场强度,因此,本论文拟采用100 mT磁场处理胰蛋白酶,并用其水解梅鱼蛋白,以探究弱磁场处理对胰蛋白酶酶解液抗菌能力、胰蛋白酶活性与结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

梅鱼 舟山国际水产城;胰蛋白酶(25000 U/g) 上海金穗生物科技有限公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonellasp)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus) 浙江海洋大学食品与医药学院食品工程实验室提供;其他试剂 均为国产分析纯。

S-3C型pH计 上海虹益仪器仪表有限公司;A-1502紫外可见分光光度计 上海谱元仪器有限公司;NICOLET NEXUS67红外可见光谱仪 美国Beckman公司;Bencbtop K型真空冷冻干燥机 上海齐欣科学仪器有限公司;日立L-8900全自动氨基酸分析仪 日立高新技术公司;JASCO-1500圆二色CD光谱仪 英国Applied Photo Physics公司。

1.2 实验方法

1.2.1 弱磁场处理装置 实验采用的弱磁场处理装置如图1所示。磁场由一组直径40 cm的亥姆霍兹线圈产生,线圈上缠绕铜线150圈,线圈之间相隔20 cm,在线圈中轴线附近可产生均匀的、方向垂直的磁场。将受试样品置于中轴线附近,磁场激发波形和振幅可通过示波器进行控制。采用数字式高斯计轴向电极检测磁场强度。

图1 弱磁场装置Fig.1 Weak magnetic field device

1.2.2 弱磁场处理胰蛋白酶 室温(25 ℃)下将1 g胰蛋白酶(25000 U/g)溶于100 mL蒸馏水中,磁场强度参数为100 mT,样品置于线圈中心处理2 h后保存备用。

1.2.3 梅鱼蛋白酶解液的制备 将梅鱼的头、内脏及大的鱼骨去掉,清洗剩下的鱼肉,沥水后用搅拌机搅碎,将搅碎的鱼肉装袋,放入冰箱冷冻保存。取梅鱼鱼肉100 g,加入900 mL蒸馏水,将pH调至8,随后室温(25 ℃)下将弱磁场处理后的胰蛋白酶按照 25000 U/100 g的比例加入鱼糜液中,以不经磁场处理的胰蛋白酶作为对照组,在胰蛋白酶最适条件水浴搅拌水解至一定时间,水解结束后置于100 ℃水浴锅灭活10 min,待酶解液冷却后在10000 r/min、4 ℃条件下离心15 min,取上清液备用。

1.2.4 抗菌活性测定 将冷冻保存的菌种划线接种至平板培养基,37 ℃培养24 h后挑单菌落接种至100 mL液体培养基,37 ℃、200 r/min摇床培养过夜制得菌液加入到冷却至50 ℃左右的平板培养基中,混合均匀,倾注平板(约20 mL/平板),水平静置凝固后备用。

采用牛津杯平板法,将指示菌固体培养基融化冷却后倒平板,待平板凝固后,均匀放入牛津杯,再将指示菌半固体培养基融化后冷却至45～50 ℃,把100 μL的指示菌液接入指示菌半固体培养基中,倒平板。待平板凝固后再将牛津杯拔出,在孔中加入10 mg/mL磁场处理前后的梅鱼蛋白酶解液100 μL,40 ℃扩散2 h,37 ℃培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径以表征其抗菌活性[20]。

1.2.5 酶活性测定 将TAME 29.0 mg溶于50 mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中,定容至100 mL配置成底物缓冲液。测定时,向比色皿中加入2.8 mL底物缓冲液再与0.2 mL预热至25 ℃的酶液混匀,在247 nm下检测吸光值,每30 s读数一次,共计5 min。然后根据时间间隔与相应的吸光值的增量(ΔA247)来计算胰蛋白酶的活性,在1 min内引起吸光度增加 0.001 所需的酶量为一个酶活单位(U/min)。酶活的计算公式为:

1.2.6 氨基酸测定 将经弱磁场处理后的胰蛋白酶放入离心管中,随后放置-18 ℃冰箱中冷冻,待冷冻完全后取出样品放置真空冷冻干燥机中进行干燥处理,48 h后取出样品,密封后放置于冰箱保存待用。对照组胰蛋白酶处理方法同上。先称取20 mg样品,将样品放置于玻璃试管,随后向玻璃试管中加入5 mL 6 mol/L的HCl,涡旋60 s混匀,随后氮吹5 min,于110 ℃条件下加热分解22 h,冷却至室温,并定容至50 mL。取1 mL样品加入15 mL离心管中,再用0.02 mol/L的HCl定容至5 mL,经漩涡离心后,取1 mL过0.45 μm滤膜后上氨基酸分析仪进行分析[21]。

1.2.7 红外光谱 按照1.2.2的方法处理胰蛋白酶,分别取未经弱磁场处理的胰蛋白酶样品及弱磁场处理2 h的样品同溴化钾在室温(25 ℃)下混合,压片,放入红外光谱扫描仪中进行扫描。以波数为横坐标,透光率为纵坐标,分析其红外光谱的变化[22]。

1.2.8 圆二色谱(CD) 本文选用Feng等[23]的方法加以修改,配制质量浓度为0.15 g/L的胰蛋白酶,每次进样量为 400 μL,室温25 ℃,扫描范围为190～250 nm,分辨率为0.1 nm,扫描速度为100 nm/min,响应度为0.5 s,CD灵敏度为0.01×10-3,光谱带宽为1.0 nm,扫描3次,取平均值。

1.3 数据处理

实验所得数据均用Origin Pro 8.5软件作图,通过SPSS 22.0软件进行结果统计分析,试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 弱磁场处理胰蛋白酶对梅鱼蛋白酶解液抗菌活性的影响

如表1所示,利用100 mT磁场处理胰蛋白酶并用其水解梅鱼蛋白,单位浓度酶解液对各种选择的指示菌的抑菌率都得到提高(以抑菌圈为指标),其中大肠杆菌(Escherichiacoli)指示菌抑菌圈直径由(4.71±0.22) mm提高至(8.54±0.23) mm，且差异显著,表明弱磁场处理会增强酶解抗菌液的抗菌活性,经弱磁场处理获得的酶解抗菌液抗菌活性均高于不经磁场处理的对照组。推测磁场会改变胰蛋白酶的空间结构进而调整胰蛋白酶的专一性,提高胰蛋白酶的活性进而导致酶解液的抗菌活性提高。

表1 磁场处理前后胰蛋白酶解梅鱼蛋白所获酶解液的抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of enzymatic hydrolysate produced by small yellow croaker hydrolyzed by trypsin untreated and treated by weak magnetic field

2.2 弱磁场处理对胰蛋白酶活性的影响

由图2可知,经磁场处理后的胰蛋白酶活性有所增高,磁场处理2 h后,酶活为368.5 U/min,相较于未处理组的316.0高出了52.5 U/min,表现为显著性提高。因此,磁场处理对胰蛋白酶的活性的具有一定的影响,在一定程度上,胰蛋白酶的活性会因为磁场的处理而升高。据报道,胰蛋白酶是依赖于顺磁性金属离子Zn2+的金属蛋白酶,而Zn2+对弱磁场作用比较敏感,酶活性中心结构受外加磁场的影响后导致酶构象改变进而导致酶活性变化[16]。此外,磁场处理也会改变水溶液的粘度、表面张力、电导率等物理化学性质,因此也可能通过影响水分子的结构改变水中氢键的长度和强度,从而使酶的构象发生改变进而导致酶活变化[24]。

图2 弱磁场处理前后的胰蛋白酶活性Fig.2 Activity of trypsin enzyme untreated and treated by weak magnetic field注:不同小写字母表示差异显著,P<0.05。

2.3 弱磁场处理对胰蛋白酶氨基酸种类及含量的影响

由表2可知,弱磁场处理之前胰蛋白酶中的氨基酸总量为67.924 mg/g,其中必需氨基酸含量为26.513 mg/g,占总氨基酸的39.03%。经弱磁场处理2 h后氨基酸总量为10.947 mg/g,其中必需氨基酸的含量为6.518 mg/g,占总氨基酸的59.54%。弱磁场处理胰蛋白酶会影响其氨基酸种类及数量,其必需氨基酸占比上升,氨基酸总量下降。由2.2可知,经弱磁场处理后,胰蛋白酶的活性有一定程度的提高,推测胰蛋白酶的侧链发生了变性导致氨基酸总量下降而活性上升。

表2 胰蛋白酶氨基酸组成及含量Table 2 Composition and contents of amino acid of trypsin

2.4 弱磁场处理对胰蛋白酶结构的影响

2.4.1 弱磁场处理对胰蛋白酶红外光谱的影响 蛋白质主链的构象主要由酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的特征峰确定,1600～1700 cm-1间为酰胺Ⅰ带的特征吸收频率,为蛋白质二级结构变化的敏感区域,是由蛋白多肽骨架的 C=O 伸缩振动引起的,1500～1600 cm-1处为酰胺Ⅱ带的特征吸收频率,主要为C-N伸缩振动与N-H弯曲振动的反映,1200～1330 cm-1间的谱带归属于酰胺Ⅲ带,也由C-N伸缩振动与N-H弯曲振动引起[25]。弱磁场处理前后的红外光谱如图3所示,弱磁场未处理时酰胺Ⅰ带(1600～1700 cm-1)主要吸收峰出现在1651.33 cm-1处,酰胺Ⅱ带(1500～1600 cm-1)出现在1515.86 cm-1处,而酰胺Ⅲ带(1200～1330 cm-1)吸收峰出现在1291.97 cm-1处;当弱磁场已处理2 h时酰胺Ⅰ带(1600～1700 cm-1)主要吸收峰出现在1639.92 cm-1处,酰胺Ⅱ带(1500～1600 cm-1)出现在1508.72 cm-1处,而酰胺Ⅲ带(1200～1330 cm-1)吸收峰出现在1286.27 cm-1处;经弱磁场处理后的胰蛋白酶峰值整体蓝移,其可能的原因是由于弱磁场处理使胰蛋白酶的分子内部去折叠,氢键减少所导致的。也有可能是水中的氢键在磁场作用下发生改变,水的电导率随黏度降低而增加,磁场作用于作为强极性分子的水分子后产生的洛伦兹力导致氢键解体或水分子集团的形状改变,改变水分子的表面张力[26],与酶结合的水分子物化性质的改变最终导致酶构象发生改变。

图3 弱磁场处理前后胰蛋白酶的红外光谱 Fig.3 Infrared spectra of trypsin untreated and treated by weak magnetic field

2.4.2 弱磁场处理对胰蛋白酶二级结构的影响 摩尔椭圆率(表示圆二色谱(CD)色性,从图4可知,通过分析CD图谱发现,磁场处理前的胰蛋白酶圆二色谱图在195 nm附近有一个正峰,在208 nm附近有一负峰,说明胰蛋白酶具有由α-螺旋和β类结构构成的高度有序结构,且在208 nm附近的负峰强于195 nm附近的正峰,说明α-螺旋在胰蛋白酶的二级结构组成中占主体地位。而在磁场处理后,胰蛋白酶的圆二色谱发生变化,195和208 nm处的峰值上升,表明胰蛋白酶二级结构中α-螺旋和β-折叠含量发生了增加。通过曲线拟合软件CD pro计算得到胰蛋白酶在磁场处理前后的二级结构如表3所示,发现在磁场作用下,胰蛋白酶的二级结构同弱磁场未处理组的胰蛋白酶相比,α-螺旋、β-折叠、β-转角及不规则卷曲都发生了不同程度的改变,其中α-螺旋和β-折叠均发生增加,α-螺旋增加量为5.1%,β-折叠增加了6.0%,β-转角增加量仅为0.9%,而无规则卷曲则出现减少,减少量为12%。说明弱磁场的处理使得胰蛋白酶二级结构各单元之间发生转化,即导致胰蛋白酶的构象发生改变。推测其原因可能是磁场处理导致胰蛋白酶分子内部电荷分布发生变化,导致原有维系其螺旋和折叠结构定性的氢键取向发生改变,进而导致其二级结构发生改变[27-29]。

表3 弱磁场处理前后胰蛋白酶的二级结构Table 3 Secondary structure of trypsin untreated and treated by weak magnetic field

图4 弱磁场处理前(A)与磁场处理后(B)胰蛋白酶的圆二色谱Fig.4 Circular dichroism of trypsin untreated(A)and treated(B)by weak magnetic field

3 结论

经弱磁场处理后,胰蛋白酶制得的单位浓度酶解液对各种选择指示菌的抑菌率均得到提高;经弱磁场处理过胰蛋白酶比未处理胰蛋白酶的酶活高出了52.5 U/min,氨基酸总量下降,必需氨基酸占比上升。胰蛋白酶的红外吸收峰发生移动,弱磁场处理可能会使胰蛋白酶分子内部去折叠。同弱磁场未处理胰蛋白酶相比,磁场处理胰蛋白酶二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角及不规则卷曲都发生了不同程度的改变,其中α-螺旋和β-折叠均发生增加,无规则卷曲则出现减少,弱磁场处理会对胰蛋白酶的二级结构产生影响。

磁场在一定程度上影响了胰蛋白酶的结构进而影响了酶活性,而酶结构和活性的改变影响了胰蛋白酶的专一性进而导致梅鱼蛋白酶解液的抗菌活性得到提高。但是实验并没有对胰蛋白酶活性增强和构象变化之间的关系进行深入分析,下一步将通过荧光光谱,核磁共振等具体分析其二级结构以及三级结构的变化,以此来说明其酶学性质变化的机理。