丹参素对银屑病样细胞Yes相关蛋白表达及细胞增殖、凋亡的影响

贾金靖 莫秀梅 刘俊峰 王宁 郑焱 陈达灿

1西安交通大学第二附属医院皮肤科710004；2广州中医药大学第二附属医院皮肤科510120

Yes 相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo 信号通路的关键组分，其在调控细胞增殖和凋亡等方面发挥重要作用［1-2］。我们的前期研究［3］发现，银屑病皮损YAP 阳性率升高，YAP 主要表达于皮损组织基底层和棘层下部，基底层作为表皮的生发区，提示YAP 在银屑病表皮异常增殖中发挥重要作用。治疗银屑病的方剂中丹参多见［4-5］。体外实验研究表明，丹参素在多种肿瘤细胞中均有抑制细胞增殖、引起细胞周期阻滞、诱导凋亡以及抑制侵袭和转移等作用［6-10］。用含白细胞介素1α（IL-1α）、IL-17、IL-22、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、抑癌蛋白M（oncostatin M）的混合物M5刺激人永生化表皮细胞（HaCaT）后其病理生理学特征与银屑病高度类似，既往有很多文献将其作为银屑病样细胞模型［11-13］。本研究检测丹参素对M5诱导的银屑病样细胞模型中YAP 的表达情况，探讨其对角质形成细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响。

资料与方法

一、实验材料与仪器

HaCaT 细胞（上海复祥生物科技有限公司）、DMEM 培养液（美国HyClone 公司）、丹参素（C9H10O5，相对分子质量162.14，纯度95%，大连美仑生物技术有限公司）、M5（IL-1a、IL-17、IL-22、TNF-α、Oncostatin M，美国PeproTech 公司）。兔抗人YAP 抗体（美国Cell Signaling 公司）。细胞周期相关蛋白抗体：兔抗人细胞周期蛋白A（Cyclin A）、兔抗人Cyclin B1、鼠抗人Cyclin D1、鼠抗人Cyclin E（美国Santa Cruz公司）。细胞凋亡相关蛋白抗体：兔抗人胱天蛋白酶3剪切体（cleaved-caspase-3）、兔抗人p21（沈阳万类科技有限公司），兔抗人Bcl-2、兔抗人BAX（美国Cell Signaling公司）。鼠抗人p53（美国Santa Cruz 公司）。鼠抗人β 肌动蛋白抗体、HRP 标记的羊抗兔二抗、HRP 标记的羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）。细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。流式细胞仪（FACSCalibur，美国BD公司）。

二、银屑病样细胞模型构建

HaCaT细胞由含10%胎牛血清及100 U/L青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM 培养液在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。采用M5（含10 μg/L 的IL-1α、IL-17、IL-22、TNF-α、Oncostatin M）作用于细胞48 h，制作银屑病样细胞模型［11-13］。HaCaT 细胞加入M5的同时分别加入0（丹参素对照组，以下简称对照组）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素刺激细胞，以未做处理的HaCaT细胞为空白对照组。

三、实时定量PCR检测丹参素对银屑病样细胞模型YAP mRNA表达的影响

丹参素刺激细胞48 h 后，采用Trizol 试剂盒提取各实验组细胞总RNA，反转录得到cDNA 后扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，YAP引物序列：正向5′-GCTAGACCCAAGGCTT GACC-3′，反向5′-ATTTGCTGTGCTGGGATTGA-3′；GAPDH 引物序列：正向5′-CACTGTGCCCATCTAC GAGG-3′，反向5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。PCR 扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40 个循环，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值，采用2-ΔΔCt法计算YAP mRNA的相对表达。

四、Western 印迹检测丹参素对银屑病样细胞模型YAP及相关蛋白水平的影响

丹参素刺激细胞48 h后，提取各组细胞总蛋白并进行蛋白定量，取25 μg 蛋白行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原，加入特异性一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育1 h，曝光、显影、定影，扫描后用Image J 软件分析目标条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

五、细胞增殖实验

采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞的增殖能力。取对数生长期细胞接种于96 孔板，每孔5 ×103个细胞加200 μl培养液，培养24、48、72 h后，每孔加入MTT 20 μl，避光孵育4 h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min，使结晶物充分溶解，采用酶标仪490 nm 波长测定各孔吸光度（A 值）间接反映活细胞数量。每组设5个复孔。

六、细胞周期检测

按照细胞周期试剂盒说明书操作，常规消化各组细胞，PBS 洗涤2 次，于-20 ℃、75%乙醇溶液中固定过夜，再次用PBS 洗涤2 次，加入终浓度为100 μg/ml的RNaseA和50 μg/ml的PI染色液，37 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测各组细胞周期，激发波长488 nm，采用Modifit 软件分析检测结果。Western印迹检测丹参素刺激48 h后各组细胞细胞周期相关蛋白的相对表达。

七、细胞凋亡检测

按照细胞凋亡试剂盒说明书操作，常规消化各组细胞，PBS 洗涤2 次，2 000 转/min（离心半径9.7 cm）离心5 min，收集1×105～5×105个细胞，加入500 μl 的结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC 混匀后再加入5μl PI 染色液混匀，室温避光孵育5 ～15 min，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。Western印迹检测丹参素刺激48 h后各组细胞凋亡相关蛋白的相对表达。

八、统计学方法

结 果

一、YAP在银屑病样细胞模型中的表达

实时定量PCR 与Western 印迹结果显示，银屑病样细胞模型组YAP mRNA、蛋白相对表达（2.03 ± 0.04、2.20 ± 0.02）均高于HaCaT 细胞组（0.95 ± 0.03、1.01 ± 0.02，t = 21.93、44.38，均P ＜0.001）。见图1。

二、丹参素对银屑病样细胞模型YAP 表达的影响

实时定量PCR 与Western 印迹结果显示，空白对照组与0（对照组）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组YAP mRNA、蛋白的相对表达水平差异有统计学意义（F = 93.96、56.65，P ＜0.001），对照组YAP mRNA、蛋白的相对表达水平均高于空白对照组（P ＜0.001），亦高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组（均P ＜0.05），YAP mRNA 及蛋白表达水平随丹参素浓度的增加呈降低趋势。见图2。

三、丹参素对银屑病样细胞模型增殖能力的影响

空白对照组、对照组与0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组细胞分别在培养24、48、72 h 时的增殖活力差异均有统计学意义（F=43.17、71.65、88.39，均P ＜0.001），在培养24 h时，对照组细胞增殖活力高于0.5 mmol/L 丹参素组细胞（P ＜0.001）；培养48、72 h 时，对照组细胞增殖活力均高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组（均P ＜0.05），且随着丹参素浓度的增加增殖能力呈降低趋势。见图3。

图1 Western 印迹检测YAP 在银屑病样细胞模型中的表达银屑病样细胞组YAP蛋白的表达高于HaCaT细胞组

图2 实时定量PCR（2A）与Western 印迹（2B）检测丹参素对银屑病样细胞模型YAP 表达的影响 丹参素可抑制银屑病样细胞模型中YAP mRNA、蛋白的相对表达。1：空白对照组；2 ～5：分别为0（对照组）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组。a：与对照组相比，P ＜0.01

图3 MTT 法检测丹参素处理银屑病样细胞模型24、48、72 h对细胞增殖的影响 丹参素可抑制银屑病样细胞模型的增殖。a：与对照组相比，P ＜0.01

四、丹参素对银屑病样细胞模型细胞周期的影响

空白对照组、0（对照组）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组G0/G1 期、S 期、G2/M 期细胞比例差异均有统计学意义（F = 61.55、313.60、9.20，均P ＜0.01）。0（对照组）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组进一步两两比较，除对照组与0.125 mmol/L 丹参素组、0.25 与0.5 mmol/L 丹参素组间G0/G1 期细胞比 例，0.125 与0.25 mmol/L 丹参素 组、0.25 与0.5 mmol/L 丹参素组间G2/M 期细胞比例差异无统计学意义（均P ＞0.05），余各组间两两比较差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组G2/M 期细胞比例高于对照组，S 期细胞比例低于对照组；0.25、0.5 mmol/L 丹参素组G0/G1期细胞比例高于对照组。见图4。

Western印迹结果显示，空白对照组、对照组与0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E 蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（F = 206.50、92.89、280.36、48.45，P ＜0.001）。对照组、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组间两两比较差异均有统计学意义（均P ＜0.05），对照组相对表达水平均高于0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组。见图5。

五、丹参素对银屑病样细胞模型凋亡的影响

空白对照组、对照组与0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组的凋亡率差异有统计学意义（F=154.08，P ＜0.001），对照组、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组间两两比较，除对照组与0.125 mmol/L 丹参素组差异无统计学意义（P ＞0.05），余各组间两两比较差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。对照组凋亡率低于0.25、0.5 mmol/L丹参素组。见图4。

Western印迹结果显示，空白对照组、对照组与0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹 参 素 组 细 胞cleavedcaspase-3、Bcl-2、BAX、p53、p21 的相对表达水平差异均有统计学意义（F=15.42、19.36、33.98、17.11、26.81，P ＜0.001），0.5 mmol/L 丹参素组cleavedcaspase-3 水平高于对照组、0.125 mmol/L 丹参素组（均P ＜0.05），对照组、0.125 与0.25 mmol/L 丹参素组间两两比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹参素组Bcl-2 水平低于对照组、0.125 mmol/L丹参素组（均P ＜0.05），对照组、0.125与0.25 mmol/L 丹参素组间两两比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹参素组BAX 水平高于0.25 mmol/L 丹参素组，0.25 mmol/L 丹参素组高于0.125 mmol/L 丹参素组及对照组（均P ＜0.05），对照组与0.125 mmol/L丹参素组间差异无统计学意义（P ＞0.05）；0.5 mmol/L丹参素组p53水平高于对照组、0.125 mmol/L 丹参素组（均P ＜0.05），0.125 与0.25 mmol/L 丹参素组、0.25 与0.5 mmol/L丹参素组甲差异无统计学意义（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹参素组p21 水平高于0.25 mmol/L 丹参素组，0.125 mmol/L 丹参素组高于对照组（均P ＜0.05），0.125与0.25 mmol/L丹参素组间差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图5。

图4 流式细胞仪检测丹参素对银屑病样细胞模型细胞周期及凋亡的影响 4A、4C：丹参素处理组S期细胞比例降低，G0/G1期、G2/M期细胞比例升高；4B、4D：丹参素可促进细胞凋亡。1：空白对照组；2 ～5：分别为0（对照组）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组。a：与对照组相比，P ＜0.05

图5 Western印迹检测丹参素刺激48 h后各组细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白的表达 对照组Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E蛋白相对表达水平高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹参素组；对照组cleaved-caspase-3 相对水平低于0.5 mmol/L 丹参素组，BAX 水平低于0.25、0.5 mmol/L丹参素组，p53、p21水平低于0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组，Bcl-2水平均高于0.5 mmol/L丹参素组。1：空白对照组；2 ～5：分别为0（对照组）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹参素组。a：与对照组相比，P ＜0.05

讨 论

近来研究发现，YAP在多种恶性肿瘤中表达上调，参与肿瘤的发生、发展［14］。D′Addario 等［15］发现，在正常人原代角质形成细胞中过表达YAP 后，可使原代角质形成细胞永生化增殖，阻碍其正常分化进程。以往研究发现，YAP 可通过下游RASAKT/ERK 通路促进皮肤鳞状细胞癌的进展［16］，我们既往的研究证实，YAP在银屑病皮损组织中表达增加［3］，提示YAP可能作为银屑病发病机制中的关键分子，如能通过外界手段干预其表达，将有望发挥治疗银屑病的作用。丹参是治疗银屑病的常用中药之一，体外实验发现，在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑素瘤等多种肿瘤细胞中，丹参素均有抑制细胞增殖、引起细胞周期阻滞、诱导凋亡以及抑制侵袭和转移等作用，上述作用可能与其较强的自由基清除和抗氧化活性、抑制AKT 以及ERK1/2 的磷酸化水平有关［6-10］，这些机制及通路与我们前期研究中YAP 在皮肤鳞状细胞癌中发挥作用的相关信号通路一致［16］。

本研究结果表明，丹参素可以抑制银屑病样细胞模型中YAP mRNA 及蛋白的表达，同时也可以抑制细胞增殖、引起细胞周期阻滞在G0/G1 期，并且不同程度地抑制细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1 及Cyclin E 的表达，而这些蛋白的表达可通过影响细胞周期的转换进而影响细胞的增殖［17］。因此，我们推测，丹参素可能正是通过影响这些细胞周期蛋白的表达发挥抑制银屑病细胞增殖的作用，引起细胞周期阻滞在G0/G1期。细胞凋亡相关蛋白中，Caspase-3 是多种凋亡途径的下游效应部分，被认为是调控凋亡的执行蛋白酶，其激活（即被剪切为cleaved-caspase-3）代表细胞凋亡机制进入了不可逆转的阶段［18］；Bcl-2 和BAX 同属于Bcl-2 家族，二者在调亡调控过程中功能是相互对抗的，Bcl-2 表达高于BAX 时，抑制细胞凋亡，反之则促进细胞凋亡［19］。P53 基因是人体内的抑癌基因，有促凋亡的作用，而p21 是其下游调控细胞凋亡的关键靶基因［20］。本研究发现，丹参素可诱导银屑病样细胞的凋亡，并同时增加促凋亡蛋白cleaved-caspase-3、BAX、p53、p21的表达，抑制Bcl-2的表达，提示丹参素可能是通过影响这些凋亡相关蛋白的表达促进银屑病样细胞的凋亡。既往研究证实［3］，在HaCaT细胞中敲除YAP后可抑制细胞的增殖，促进凋亡，将细胞周期阻滞在G0/G1期，本文中丹参素对银屑病样细胞的作用与上述HaCaT 细胞中敲除YAP 后细胞的表现高度吻合，且引起细胞周期相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达改变趋势也基本一致。同时，本研究也发现，丹参素可呈剂量依赖性地降低YAP 的表达水平，因此推测丹参素通过影响YAP 的表达，进而抑制了银屑病表皮角质形成细胞的异常增殖而发挥治疗作用。

综上，本研究结果提示，丹参素可能通过抑制银屑病样细胞中YAP 的表达，进而发挥细胞周期阻滞、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。本研究尚处在初步探索阶段，具体的信号通路机制等仍有待后续研究进一步完善。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突