lncRNA LEF1-AS1 通过靶向miR-612 调控皮肤鳞状细胞癌细胞株增殖、凋亡、迁移侵袭的体外实验研究

郑云鹏 李旭阳 蔡丙杰 李冬芹 尹光文

郑州大学第一附属医院皮肤科450052

皮肤鳞状细胞癌（简称皮肤鳞癌）是一种常见的皮肤恶性肿瘤，部分患者可发生快速转移，影响皮肤外观和预后［1-4］。早期快速准确地控制肿瘤进展对患者具有重要意义。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miR）均为常见的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），其在机体癌症中的促进功能或者抑制功能均已得到很多研究的认可［5-6］。lncRNA LEF1-AS1 在多种癌症中均已有研究报道，但是在皮肤鳞癌中的功能及机制尚不清楚。本实验通过生物信息学预测LncRNA LEF1-AS1 的靶向miRNA，发现LncRNA LEF1-AS1 与miR-612 有结合位点，且研究报道LncRNA LINC00460通过使miR-612海绵化可促进头颈部鳞癌细胞的增殖，迁移和侵袭［7］。但miR-612在皮肤鳞癌中的功能尚不清楚。本研究以皮肤鳞癌细胞SCC13 为研究对象，检测lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表达，观察干扰lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表达对其增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。

材料与方法

一、实验材料

收集郑州大学第一附属医院2018 年3 月至2019 年6 月外科手术切除的20例皮肤鳞癌及对应的癌旁组织。本研究符合2013 年修订的《赫尔辛基 宣 言》（https：//www.wma.net/policies-post/wmadeclaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medicalresearch-involving-human-subjects/）的要求，所有受试者均签署知情同意书。

SCC13细胞（编号：CVCL_4029）购自美国模式培养物集存库。实时荧光定量逆转录PCR（qRTPCR）检测试剂盒、反转录试剂盒（日本Takara 公司）；LipofectamineTM2000 脂质体转染试剂盒（美国Invitrogen 公司，规格：1.5 ml）；CCK8 细胞计数试剂盒（日本同仁化学研究所）；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）双染细胞凋亡检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；迁移实验（Transwell）小室（美国Corning 公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega 公司）。 流 式 细 胞 仪（Cytomics FC 500，美 国BECKMANCOULTER公司）。

二、qRT-PCR法检测组织中皮肤鳞癌及癌旁组织中LEF1-AS1、miR-612的表达

将充分研磨的组织用RNA提取试剂盒抽提总RNA，再用反转录试剂盒将其合成cDNA，采用qRT-PCR 检测试剂盒检测lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表达，以GAPDH、U6为内参，引物由南京科佰生物科技有限公司合成，序列见表1，以2-△△Ct法分析lncRNA LEF1-AS1、miR-612的相对表达量。

三、SCC13细胞的培养与分组

使用含10%胎牛血清的DMEM 培养基在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中常规培养和传代SCC13 细胞。按脂质体LipofectamineTM2000 试剂的说明书操作将lncRNA LEF1-AS1 的干扰无意义序列（si-NC）、lncRNA LEF1-AS1 的干扰序列（si-LEF1-AS1）、miR-612 过表达的无意义序列（miR-NC）、miR-612 过表达基因序列（miR-612）转染至SCC13 细胞，记为si-NC 组、si-LEF1-AS1 组、miR-NC组、miR-612组；将si-LEF1-AS1分别与抑制miR-612 表达的无意义序列（anti-miR-NC）、抑制miR-612 表达基因序列（anti-miR-612）共转染至SCC13 细胞中，记为si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 组和si-LEF1-AS1+anti-miR-612 组；各组在转染8 h后弃去培养基继续培养48 h，用qRT-PCR法检测转染的效率，确定转染成功后用于后续实验研究。

四、干扰lncRNA LEF1-AS1表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

取si-NC 组、si-LEF1-AS1 组SCC13 细胞，采用CCK8 法检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞的凋亡情况，Transwell试验检测细胞的迁移、侵袭能力，Western印迹检测增殖相关蛋白细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂（p21），凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax），迁移及侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的相对水平。

1.CCK8 法检测细胞增殖：以100 μl、5×105个细胞置于96孔板中，培养24、48、72 h，加入20 μl的CCK8溶液，使用酶标仪在490 nm波长检测各组细胞的吸光度（A值）。以A值反映细胞的增殖能力。

2.流式细胞仪分析细胞凋亡：收集细胞，使用结合缓冲液重悬，按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书要求操作，避光孵育待测细胞，快速上流式细胞仪检测分析细胞的凋亡情况。凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。

3.Transwell 试验检测细胞的迁移、侵袭能力：收集细胞，先用不含血清的培养基培养24 h，取1×105/ml 细胞100 μl 均匀铺在上室表面，下室内加入700 μl含有血清的培养基，将小室置于恒温培养箱中培养24 h，取出小室后，进行甲醇固定、结晶紫染色，显微镜下观察穿膜细胞数，取5个视野拍照，计算平均值。选用含有基质胶的小室检测细胞的侵袭能力，不含基质胶的小室检测细胞的迁移能力。

表1 实时荧光定量逆转录PCR引物信息

4.Western印迹试验：收集细胞，裂解后提取总蛋白，使用BCA 法对蛋白进行定量。目的蛋白沸水浴变性处理，取上清液上样电泳，经转膜、封闭后，将膜转移至一抗溶液（1∶500）中，4 ℃下孵育过夜。将膜转移至相应的二抗稀释液（1∶1 000）中，室温孵育2 h，通过超敏ECL 发光试剂盒显影、定影、曝光。使用Quantity One 4.6软件分析条带灰度值，以GAPDH 为参照，以目的条带灰度值与GAPDH 条带的比值为cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相对表达水平。

五、过表达miR-612对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

取miR-NC 组、miR-612 组SCC13 细胞，采用CCK8 法检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞的凋亡情况，Transwell 试验检测细胞的迁移、侵袭能力，Western 印迹检测cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相对水平。

六、lncRNA LEF1-AS1 与miR-612 的结合能力检测

用LncBase Predicted v.2 在线预测网站（http：//carolina.imis.athena - innovation.gr/diana_tools/web/index.php？r=lncbasev2%2Findex-predicted）预 测lncRNA LEF1-AS1 与miR-612 之间的互补序列，根据互补序列设计合成有互补结合位点的WT-LEF1-AS1序列和无互补结合位点的MUT-LEF1-AS1序列（图1），并将其克隆至荧光载体上，构建荧光素酶报告基因质粒，分别与miR-NC、miR-612 共转染至SCC13细胞，转染48 h后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒要求操作，检测细胞的萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，以二者的比值表示报告基因的表达水平。

将LEF1-AS1过表达的无意义序列（LEF1-AS1-NC）、LEF1-AS1 过表达基因序列（LEF1-AS1）、si-NC、si-LEF1-AS1 转染至SCC13 细胞中，采用qRT-PCR 法检测各组细胞miR-612 的相对表达水平，以检测lncRNA LEF1-AS1 对miR-612 的调控作用。

图1 根据长链非编码RNA LEF1-AS1与微小RNA-612（miR-612）之间的互补序列设计的互补和不互补序列WT-LEF1-AS1：有互补结合位点的序列；MUT-LEF1-AS1：无互补结合位点的序列

七、干扰lncRNA LEF1-AS1 及抑制miR-612 表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

取si-NC 组、si-LEF1-AS1 组、si-LEF1-AS1 +anti-miR-NC 组、si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 组细胞，采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-612的相对表达，CCK8法检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞的凋亡情况，Transwell 试验检测细胞的迁移、侵袭能力，Western 印迹检测cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相对水平。

八、统计学处理

结 果

一、lncRNA LEF1-AS1 和miR-612 在皮肤鳞癌组织中的表达

皮肤鳞癌组织中的lncRNA LEF1-AS1 相对表达（2.93±0.29）高于癌旁皮肤组织（1.00±0.08，t=28.69，P ＜0.001），miR-612 的相对表达（0.52 ±0.05）低于癌旁皮肤组织（1.01±0.09，t=21.28，P ＜0.001）。

二、干扰lncRNA LEF1-AS1 表达对SCC13 增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

见图2、表2。si-LEF1-AS1 组细胞lncRNA LEF1-AS1 相对表达低于si-NC 组（P ＜0.05）；24、48、72 h 时细胞增殖能力低于si-NC 组（均P ＜0.05），细胞凋亡率高于si-NC 组（P ＜0.05），迁移、侵袭细胞数均低于si-NC组（均P ＜0.05）。

Western 印迹显示，si-LEF1-AS1组细胞增殖相关蛋白cyclinD1相对水平低于si-NC 组（P ＜0.05），p21 相对水平高于si-NC 组（P ＜0.05）；凋亡相关蛋白Bcl-2相对水平低于si-NC组（P ＜0.05），Bax相对水平高于si-NC 组（P ＜0.05）；迁移、侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9 相对水平均低于si-NC 组（均P ＜0.05）。见图3、表3。

三、miR-612 过表达对SCC13 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

miR-612 组细胞miR-612 相对表达高于miRNC 组（P ＜0.05）；24、48、72 h 时miR-612 组细胞增殖能力低于miR-NC 组（均P ＜0.05）；miR-612组细胞凋亡率高于miR-NC 组（P ＜0.05）；miR-612 组迁移、侵袭细胞数均低于miR-NC组（均P ＜0.05）。见图4、表4。

图2 干扰长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1表达后SCC13细胞的凋亡、迁移、侵袭能力 2A：流式细胞仪检测，si-LEF1-AS1组细胞凋亡率高于si-NC组；2B：Transwell试验检测，si-LEF1-AS1组迁移、侵袭细胞数均低于si-NC组。si-NC，转染lncRNA LEF1-AS1的干扰无意义序列；si-LEF1-AS1，转染lncRNA LEF1-AS1的干扰序列

表2 干扰长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响（±s）

表2 干扰长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响（±s）

注：n=9。si-NC：转染lncRNA LEF1-AS1的干扰无意义序列；si-LEF1-AS1：转染lncRNA LEF1-AS1的干扰序列

分组LEF1-AS1表达（2-△△Ct）细胞增殖能力（吸光度）24 h 0.33±0.03 0.29±0.03 2.83 0.012 48 h 0.69±0.06 0.37±0.03 14.32＜0.001 72 h 1.01±0.09 0.51±0.05 14.57＜0.001凋亡率（%）迁移细胞数（个）侵袭细胞数（个）si-NC si-LEF1-AS1 t值P值1.00±0.08 0.49±0.04 17.10＜0.001 7.36±0.71 21.69±2.13 19.15＜0.001 82.65±8.12 37.69±3.34 15.36＜0.001 69.48±6.87 29.64±3.36 15.63＜0.001

图3 Western 印迹检测干扰长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1 表达后SCC13 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白的表达 3A：si-LEF1-AS1 组cyclinD1 相对水平低于si-NC 组，p21 相对水平高于si-NC 组；3B：Bcl-2 相对水平低于si-NC 组，Bax 相对水平高于si-NC 组；3C：MMP-2、MMP-9相对水平均低于si-NC组。si-NC，转染lncRNA LEF1-AS1的干扰无意义序列；si-LEF1-AS1，转染lncRNA LEF1-AS1的干扰序列

表3 Western印迹检测干扰lncRNA LEF1-AS1表达后SCC13细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白的表达（±s）

表3 Western印迹检测干扰lncRNA LEF1-AS1表达后SCC13细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白的表达（±s）

注：n=9。si-NC：转染lncRNA LEF1-AS1的干扰无意义序列；si-LEF1-AS1：转染lncRNA LEF1-AS1的干扰序列

分组 增殖相关蛋白cyclinD1 0.65±0.06 0.24±0.03 18.34＜0.001 p21 0.31±0.03 0.73±0.06 18.78＜0.001凋亡相关蛋白Bcl-2 0.69±0.06 0.27±0.03 18.78＜0.001 Bax 0.37±0.03 0.78±0.07 16.15＜0.001迁移、侵袭相关蛋白MMP-2 0.83±0.07 0.39±0.04 16.37＜0.001 MMP-9 0.61±0.06 0.22±0.03 17.44＜0.001 si-NC si-LEF1-AS1 t值P值

Western印迹显示，miR-612组细胞增殖相关蛋白cyclinD1 相对水平低于miR-NC 组（P ＜0.05），p21 相对水平高于miR-NC 组（P ＜0.05）；凋亡相关蛋白Bcl-2相对水平低于miR-NC组（P ＜0.05），Bax相对水平高于miR-NC 组（P ＜0.05）；迁移、侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9相对水平均低于miR-NC 组（均P ＜0.05）。见图5、表5。

四、lncRNA LEF1-AS1 靶向调控SCC13 细胞miR-612的表达

共转染WT-LEF1-AS1后，miR-612组细胞荧光活性（0.33 ± 0.03）低于miR-NC 组（1.00 ± 0.09，t =21.19，P ＜0.001）；而共转染MUT-LEF1-AS1 后，miR-612 组细胞荧光活性（0.97 ± 0.07）与miR-NC组（0.98 ± 0.08）差异无统计学意义（t = 0.28，P =0.78）。

图4 miR-612 过表达对SCC13 细胞的凋亡、迁移、侵袭能力的影响 4A：流式细胞仪检测，miR-612 组细胞凋亡率高于miR-NC 组；4B：Transwell试验检测，miR-612组迁移、侵袭细胞数均低于miR-NC组。miR-NC组，转染miR-612过表达的无意义序列；miR-612组，转染miR-612过表达基因

表4 miR-612过表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响（±s）

表4 miR-612过表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响（±s）

注：n=9。miR-NC组：转染miR-612过表达的无意义序列；miR-612组：转染miR-612过表达基因

分组miR-612（2-△△Ct）凋亡率（%）迁移细胞数（个）miR-NC miR-612 t值P值0.99±0.07 2.68±0.26 18.83＜0.001增殖能力（吸光度）24 h 0.35±0.03 0.32±0.03 2.12 0.049 28 h 0.67±0.06 0.43±0.04 9.98＜0.001 72 h 1.03±0.09 0.57±0.05 13.40＜0.001 6.89±0.67 18.46±1.73 18.71＜0.001 83.65±8.41 43.66±4.39 12.64＜0.001侵袭细胞数（个）71.64±7.32 34.69±3.87 13.33＜0.001

图5 Western印迹检测干扰miR-612过表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响 5A：miR-612组cyclinD1相对水平低于miR-NC组，p21相对水平高于miR-NC组；5B：Bcl-2相对水平低于miR-NC组，Bax相对水平高于miR-NC组；5C：MMP-2、MMP-9相对水平均低于miR-NC组

表5 Western印迹检测miR-612过表达对SCC13细胞相关蛋白的影响（±s）

表5 Western印迹检测miR-612过表达对SCC13细胞相关蛋白的影响（±s）

注：n=9。miR-NC组：转染miR-612过表达的无意义序列；miR-612组：转染miR-612过表达基因

分组 增殖相关蛋白cyclinD1 0.66±0.06 0.29±0.03 16.55＜0.001 p21 0.30±0.03 0.68±0.06 16.99＜0.001凋亡相关蛋白Bcl-2 0.71±0.06 0.33±0.03 16.99＜0.001 Bax 0.36±0.03 0.75±0.06 17.44＜0.001迁移、侵袭相关蛋白MMP-2 0.85±0.07 0.43±0.04 15.63＜0.001 MMP-9 0.62±0.06 0.26±0.03 16.10＜0.001 miR-NC miR-612 t值P值

LEF1-AS1-NC 组、LEF1-AS1 组、si-NC 组、si-LEF1-AS1 组细胞miR-612 的相对表达分别为1.00±0.09、0.49±0.04、1.01±0.08、2.53±0.25，差异有统计学意义（F=356.62，P ＜0.001），LEF1-AS1组低于LEF1-AS1-NC 组（LSD-t =15.54，P ＜0.05），si-LEF1-AS1 组高于与si-NC 组（LSD-t=17.33，P ＜0.05）。

五、干扰lncRNA LEF1-AS1 并抑制miR-612 的表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

si-NC 组、si-LEF1-AS1 组、si-LEF1-AS1+antimiR-NC 组、si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 组细胞间miR-612 的相对表达差异有统计学意义，24、48、72 h 时的增殖能力差异有统计学意义，凋亡率（图6）、迁移、侵袭细胞数（图7）差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。si-LEF1-AS1 组细胞中miR-612表达高于si-NC组，48、72 h细胞增殖能力低于si-NC组，细胞凋亡率高于si-NC组，迁移细胞数和侵袭细胞数低于si-NC 组（均P ＜0.05），而si-LEF1-AS1+anti-miR-612 组细胞中miR-612 表达低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 组，48、72 h 细胞增殖能力高于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 组，细胞凋亡率低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 组，迁移细胞数和侵袭细胞数高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 组（均P ＜0.05）。见表6。

图6 流式细胞仪检测干扰长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1并抑制miR-612的表达对SCC13细胞凋亡的影响 si-LEF1-AS1组细胞凋亡率高于si-NC组（P ＜0.05）；si-LEF1-AS1+anti-miR-612组细胞凋亡率低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC组。si-NC，转染lncRNA LEF1-AS1的干扰无意义序列；si-LEF1-AS1，转染lncRNA LEF1-AS1的干扰序列；anti-miR-NC，转染抑制miR-612表达的无意义序列；anti-miR-612，转染抑制miR-612表达基因

图7 Transwell试验检测干扰长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1并抑制miR-612的表达对SCC13细胞迁移、侵袭能力的影响 si-LEF1-AS1组迁移细胞数和侵袭细胞数低于si-NC组；si-LEF1-AS1+anti-miR-612组迁移细胞数和侵袭细胞数高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC组

Western 印迹显示，4 组细胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平差异均有统计学意义（均P ＜0.001），si-LEF1-AS1 组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均低于si-NC 组，p21、Bax 蛋白相对水平高于si-NC 组（均P ＜0.05）；而si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平高于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 组，p21、Bax 蛋白相对水平低于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 组（均P ＜0.05）。见图8、表7。

讨 论

Zong 等［8］报道，lncRNA LEF1-AS1 在食管鳞癌组织中的表达异常上调，并与患者的淋巴转移和临床分期具有显著的相关性，提示lncRNA LEF1-AS1可能是参与食管鳞癌临床进展的lncRNA，可作为潜在的预测指标。Zhang等［9］在口腔鳞癌的研究中发现，lncRNA LEF1-AS1在组织和细胞中的表达均显著升高，且与患者预后不良相关，下调lncRNA LEF1-AS1能够在体外抑制癌细胞的增殖、迁移，促进凋亡并发生G0/G1期阻滞，在体内抑制裸鼠肿瘤的生长，产生这种影响的作用机制与抑制Hippo信号通路活性具有明显的相关性，提示lncRNA LEF1-AS1 通过抑制Hippo 信号通路，从而在口腔鳞癌中发挥致癌作用。由此，我们推测lncRNA LEF1-AS1可能在皮肤鳞癌中也具有致癌作用。本研究发现，lncRNA LEF1-AS1 在皮肤鳞癌组织中的表达异常升高，干扰lncRNA LEF1-AS1 表达后，皮肤鳞癌细胞SCC13的增殖能力、迁移侵袭能力均受到明显的抑制，细胞的凋亡明显增强，这些试验结果均与lncRNA LEF1-AS1 在食管鳞癌和口腔鳞癌中的功能相呼应，提示其在皮肤鳞癌中也发挥致癌的功能。

表6 干扰长链非编码RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的作用（±s）

表6 干扰长链非编码RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表达对SCC13细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的作用（±s）

注：n=9。si-NC：转染lncRNA LEF1-AS1 的干扰无意义序列；si-LEF1-AS1：转染lncRNA LEF1-AS1 的干扰序列；anti-miR-NC，转染抑制miR-612 表达的无意义序列；anti-miR-612，转染抑制miR-612表达基因。a与si-NC 组比较，P ＜0.05；b与si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 组比较，P ＜0.05

增殖能力（吸光度）分组miR-612（2-△△Ct）si-NC si-LEF1-AS1 si-LEF1-AS1+anti-miR-NC si-LEF1-AS1+anti-miR-612 F值P值1.00±0.08 2.59±0.25a 2.56±0.26 1.41±0.14b 150.78＜0.001 24 h 0.34±0.03 0.31±0.03 0.29±0.03 0.33±0.04b 4.12 0.014 48 h 0.68±0.06 0.41±0.04a 0.38±0.03 0.57±0.04b 92.57＜0.001 72 h 1.05±0.09 0.56±0.05a 0.52±0.05 0.89±0.08b 122.15＜0.001凋亡率（%）7.74±0.76 22.64±2.24a 23.45±2.31 13.58±1.36b 160.34＜0.001迁移细胞数（个）85.69±8.55 39.65±3.87a 38.46±3.76 73.24±7.33b 131.67＜0.001侵袭细胞数（个）70.25±7.23 30.66±3.18a 28.79±2.87 59.68±5.44b 155.60＜0.001

图8 Western印迹检测干扰长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1 并抑制miR-612 的表达对SCC13 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响 cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平，si-LEF1-AS1组低于si-NC 组，si-LEF1-AS1+anti-miR-612 组高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC组；p21、Bax蛋白相对水平，si-LEF1-AS1 组高于si-NC 组，si-LEF1-AS1+anti-miR-612 组低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC组

miRNA 既可作为lncRNA 的靶标，还可作为靶基因的直接上游调控因子，其在癌症中的功能得到普遍认可［10］。miR-612在肝癌、黑素瘤中均表达异常［11-12］，发挥调控癌症进展的作用，但在皮肤鳞癌中的作用尚未十分清楚。Kang等［13］在非小细胞肺癌的研究中发现，miR-612 的表达异常降低，且与患者的临床病理分期和淋巴结转移密切相关。另外，过表达miR-612能够抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，阻止裸鼠体内肿瘤的生长，其机制为miR-612 靶向含溴结构域的蛋白4（BRD4）进而抑制PI3K/Akt 信号通路的活性，揭示miR-612/BRD4/PI3K/Akt信号通路在非小细胞肺癌中的功能，提示miR-612可能成为非小细胞肺癌患者抗癌治疗的潜在靶标。Sheng 等［14］在研究中发现，miR-612在结直肠癌组织或细胞中的表达显著降低，并且miR-612 在体外抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移，miR-612 直接靶向抑制AKT2，进而抑制下游的上皮-间质转化相关的信号通路，说明miR-612 在结直肠癌的发展中起着关键性的作用。目前，miR-612 在皮肤鳞癌中的功能尚不清楚，我们推测其在皮肤鳞癌中也具有相似的抑癌作用。CyclinD1、p21 均是细胞周期调控因子，CyclinD1 高表达，p21 低表达，提示细胞增殖增多［15］。Bcl-2、Bax 是凋亡相关蛋白，Bcl-2 抗凋亡，Bax 促凋亡［16］。MMP-2、MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员，其高表达可促进细胞外基质的降解，促进细胞迁移、侵袭［17］。本研究发现干扰LncRNA LEF1-AS1 表达和miR-612 过表达后，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低，p21、Bax蛋白表达显著升高。表明干扰LncRNA LEF1-AS1表达和miR-612 过表达可抑制皮肤鳞癌细胞的增殖、迁移侵袭，促进凋亡。本研究发现，miR-612在皮肤鳞癌组织中的表达异常降低，过表达miR-612具有与干扰lncRNA LEF1-AS1 相类似的抑制皮肤鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的作用。

表7 干扰长链非编码RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表达对SCC13细胞相关蛋白表达的影响（±s）

表7 干扰长链非编码RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表达对SCC13细胞相关蛋白表达的影响（±s）

注：n=9。注：si-NC：转染lncRNA LEF1-AS1的干扰无意义序列；si-LEF1-AS1：转染lncRNA LEF1-AS1的干扰序列；anti-miR-NC，转染抑制miR-612表达的无意义序列；anti-miR-612，转染抑制miR-612表达基因。a 与si-NC 组比较，P ＜0.05；b与si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 组比较，P ＜0.05

分组 增殖相关蛋白cyclinD1 0.64±0.06 0.26±0.03a 0.25±0.03 0.53±0.05b p21 0.32±0.03 0.74±0.06a 0.75±0.07 0.43±0.03b凋亡相关蛋白Bcl-2 0.70±0.06 0.29±0.03a 0.28±0.03 0.59±0.05b Bax 0.35±0.03 0.79±0.06a 0.80±0.08 0.46±0.04b迁移、侵袭相关蛋白MMP-2 0.84±0.07 0.38±0.03a 0.37±0.04 0.72±0.07b MMP-9 0.59±0.06 0.23±0.03a 0.22±0.03 0.48±0.04b si-NC si-LEF1-AS1 si-LEF1-AS1+anti-miR-NC si-LEF1-AS1+anti-miR-612 174.68＜0.001 166.60＜0.001 206.13＜0.001 151.87＜0.001 167.10＜0.001 175.20＜0.001 F值P值

我们通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因检测实验验证，lncRNA LEF1-AS1 可靶向作用miR-612，猜测这可能与lncRNA LEF1-AS1在皮肤鳞癌中的功能具有联系。本研究发现，抑制miR-612能够逆转干扰lncRNA LEF1-AS1 对皮肤鳞癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的调控作用。提示在皮肤鳞癌中，lncRNA LEF1-AS1 可能通过miR-612 发挥调控皮肤鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突