东北对开蕨孢子离体快繁技术研究

韩汶雨 刘建星 徐钰童 陈浩宇 于海阔

【摘   要】 该实验以东北对开蕨的孢子为外植体进行离体培养试验，得出了东北对开蕨孢子离体快繁的途径：孢子试管培养初步得出原叶体，原叶体通过扩繁数量增多，然后将这些原叶体进行试管外诱导得到孢子体，培养孢子体即可得到东北对开蕨的植株。另通过配方比较得出：试管内采用MS培养基增殖效果最好，试管外培养过程中定期喷施0.1% KH2PO4诱导剂效果最好。

【关键词】 孢子;东北对开蕨;原叶体增殖;孢子体诱导

东北对开蕨，拉丁学名：Phyllitis scolopendrium （L.） Newm.，又称日本对开蕨、长白对开蕨、东北对开蕨等，为铁角蕨科对开蕨属中的一种野生蕨类植物。该植物高约60 cm，根状茎短而直立或斜生，叶柄基部密被鳞片;叶常见3-8枚簇生，叶柄长10-20cm，叶柄颜色呈棕色至褐棕色，柄上分布着稀疏的鳞片，叶片形状为舌状、披针形，长30cm左右，端部渐尖;叶子在鲜艳的时候呈肉质，干后薄革质，棕绿色，上面光滑，叶子干后在侧脉之间有明显的洼点;东北对开蕨的孢子囊群粗线形，通常长1.5-2.5 cm，着生于相邻两小脉的一侧。东北对开蕨是世界稀有植物，我国1975年9月于长白山发现，填补了对开蕨在我国的空白，具有较高的研究价值。东北对开蕨是一种非常具有开发价值的药用植物，目前在医药上用做泌尿系统的消炎、利尿、消肿、止血剂等，其药效药理还有待进一步的研究与开发。东北对开蕨繁殖系数不高，为阴性植物，养护过程中要求湿度较大，管理成本高，因此本研究尝试进行东北对开蕨的孢子离体快繁，以提高繁殖速度和降低育苗成本。

1  材料与方法

1.1  试验材料

材料取自吉林市园林处第一苗圃温室大棚，于2019年8月23日采集东北对开蕨孢子，由于孢子位于孢子囊中，采集时将含有成熟孢子囊的孢子叶一起进行采集。采集当天直接带回组培实验室进行孢子叶的切割，孢子葉呈1cm大小。

1.2   试验方法

1.2.1 孢子接种  收集所有切割的孢子叶先放入0.1%的升贡（HgCl2）溶液中消毒8 min，清洗后用干滤纸吸掉孢子叶上的水分，放在超净台解剖镜下切割分离孢子，先将孢子囊从孢子叶上分离开来，然后放在提前裁剪好的滤纸上，滤纸裁剪大小为2cm2。用镊子紧压孢子囊，孢子囊破裂露出孢子，然后将小块滤纸及粘附的孢子一起接种到初代培养基上。初代培养基配方采用1/2MS（其中添加糖20g/L，琼脂6g/L），接种50瓶。

1.2.2 原叶体增殖培养  孢子接种后，逐步会在1/2MS培养基上进行分化，待分化出原叶体团且长成1cm大小时，在超净台下取出分割，切成径约0.2cm小块接种到增殖培养基上进行扩繁，扩繁采用200 mL组培瓶，每瓶分散接种10块。增殖培养基采用10个配方配比，配方均添加糖为15 g/L，琼脂 6g/L。培养室温度设定25℃，湿度85%，光强1000 Lx，光照时间12h/d。

1.2.3 诱导孢子体  原叶体增殖长到1 cm左右时，从容器中取出切成0.1 cm小块，将原叶体小块进行试管外培养以诱导出孢子体。试管外诱导采用盆栽方式，以草炭：蛭石=1：1的比例混合作为基质，放入温室进行培养。在诱导孢子体阶段喷施3种不同的诱导剂，以比较最佳的诱导剂。温室温度20-25℃，盆栽覆膜遮荫，保证盆内光强500Lx-1000Lx，遮阴率60%。

2  结果与分析

2.1  原叶体增殖情况

由表1可以看出，10个配方配比经过培养后均增殖出原叶体，增殖倍数均大于4.5，说明以MS或1/2MS作为基本培养基起到了促进分化扩繁的作用。根据经验一般在增殖阶段添加细胞分裂素可以提高增殖的效果，因此该试验在MS配方中分别添加了不同量的 KT和6-BA，但根据表1可以看出，添加细胞分裂素的效果并不明显。10个配方中增殖原叶体数最多的为MS基本培养基，而它的接种数为31，并不高于其他配方，它的增殖倍数为5.5，增殖得出的叶原体生长也较好，大而且平展。总体比较得出：在原叶体增殖阶段直接采用MS基本培养基就能取得良好的效果，不必要添加植物激素。

2.2  孢子体诱导情况

进行原叶体诱导目的是为了得到较多的孢子体，而孢子体经过培育就会分化出东北对开蕨的小植株。原叶体分化孢子体可以直接通过试管外基质培养，一方面提前适应自然气候，减少试管出瓶炼苗环节，另一方面也降低了试管内的养护成本。由表2可见，在养护阶段喷施诱导液均能促进孢子体形成，不添加诱导液仅仅喷施清水，孢子诱导率仅为42，但三种诱导液诱导率差别也较大，综合比较喷施0.1% KH2PO4 溶液效果最好，孢子体诱导率达到了56%。

3  结论与讨论

该实验通过采集分离东北对开蕨孢子进行离体培养，初步得出了孢子植株再生的途径：孢子试管培养初步得出原叶体，原叶体通过扩繁得到更多的数量，然后把这些原叶体进行试管外诱导形成孢子体，培养孢子体就会得到东北对开蕨的植株。在这个环节中关键是原叶体的试管增殖阶段和孢子体的试管外诱导阶段，经过比较得出了试管内采用MS培养基增殖效果最好，试管外培养过程中定期喷施0.1% KH2PO4诱导剂效果最好。在整个孢子离体培养过程中，前期阶段该实验目标仅仅为培养出原叶体以供增殖即可，因为该实验仅仅局限在实验室进行，而实际的生产中原叶体诱导也很关键，所以原叶体诱导有没有更好的配方还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 张月雅，刘明磊，颜小梅，等.4种蕨类植物耐热性测定[J].吉林农业大学学报，2015，37（03）：313-316.

[2] 樊清伟，邓志刚，张冬昱.长白山蕨类植物资源的研究进展[J].通化师范学院学报，2010，31（02）：34-36+76.

[3] 建德锋，辛立红，马 爽.金银忍冬腋芽离体培养技术研究[J].吉林农业科技学院学报，2014，23（02）：11-13+16.

[4] 顾德峰，李东升，王 雷，等. 东亚对开蕨离体快繁的研究[J].园艺学报，2008，35（9）：1373-1376.

[5] 王 阳，董 然，顾德峰，等.东北对开蕨孢子体诱导技术的研究 [J].北方园艺，2014（19）：93-98.

[6] 刘晓龙，宋 畅，白旭然，等.铁线蕨组培快繁技术研究[J].吉林农 业科技学院学报，2013，22（01）：14-15+21.

（编辑：李晓琳）