漆酶/木聚糖酶双功能作用预水解液制备糠醛的研究

刘 婧，刘海棠,2,3

(1.中国轻工业造纸与生物质精炼重点实验室，天津市制浆造纸重点实验室，天津科技大学轻工科学与工程学院，天津300457；2.中国林业科学研究院林产化学工业研究所，江苏省生物质能源与材料重点实验室，南京210042；3.天津市海洋资源与化学重点实验室(天津科技大学)，天津300457)

资源短缺和能源匮乏是现在全球面临的共同问题。据专家推断，现在世界上所有已知储备量的化石类能源，如煤炭、石油等，在200年之内将全部耗尽[1]。在被能源及环境问题限制了全球造纸工业发展的背景下，生物质精炼的发展成为不可抵挡之势。在美国能源部的支持下，美国林产与造纸工业协会（American Forest and Paper Association,AF&PA）制订了2020年发展规划[2]，提出了“高效组合的林产品生物精炼”（integrated forest products biorefinery,IFBR）的概念，核心是整合全部的生物质原料，比如木材纤维等，并通过能源转化、包装等手段充分发挥利用其自身的价值[3]。制浆造纸产业会消耗大量的生物质资源（主要是木、竹、草等），在其所有的工序中，除了纤维素以纸浆的形式被有效地使用之外，大部分半纤维素和木质素都以废液的形式被排出或焚烧，不仅增加了环境负荷，还浪费了大量的生物质资源。在全球资源不足和能源危机的背景下，生物质精制的概念被用于改变传统的造纸产业，特别预水解液的增值化利用给传统造纸行业带来了额外的利润。

预水解液的成分比较复杂，包括低聚木糖、木糖、木质素、甲酸、乙酸和糠醛等。其中，木糖含量最高，是生产糠醛的最主要原材料，拥有很高的潜在价值。木素作为预水解液中仅次于木糖的成分，也拥有重要的商业价值，它本身就是一种天然的胶黏剂和黏合剂，经过加工还可以制备成为燃料；在生产无烟煤和无硫固体燃料的原料中，木素就占了一定比例。乙酸是预水解物中的重要成分，主要用于生产乙醇、乙酸酐、乙酸盐和乙酸纤维素等[4]。另外，乙酸在工业中的应用十分广泛，在生产药物、杀虫剂等领域有十分重要的应用。倪永浩等[5]尝试研究乙酸在工业生产中的循环利用，以预水解液为原料，用三辛胺/正辛醇体系萃取乙酸，再用氢氧化钠反萃取，回收乙酸，并且取得了不错的成效。

与预水解液中的其他物质相比，糠醛的含量是比较低的，但是这并不影响糠醛拥有最高的价值，其是化工领域30 种高价值基础化学品之一。Di Blasi等[6]进行生产糠醛的实验，以几种阔叶木、针叶木及农作物秸秆等作为原料进行分析比对，结果表明用玉米芯生产糠醛的效果最好。分析得出玉米芯生产糠醛效果最好的原因是，玉米芯中拥有大量的半纤维素，而半纤维素的水解产物主要是木糖。

本文结合已有研究结果，以桉木预水解液为原料，在漆酶/木聚糖酶协同作用下去除部分木素，同时降解低聚木糖为木糖；然后以硫酸为催化剂对生产糠醛的工艺条件进行研究，以期探究糠醛生产的最适条件，实现造纸废液的高值化利用，减少对环境的污染。

1 实验

1.1 原料和试剂

桉木预水解液(PHL)由山东太阳纸业提供。浓硫酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、糠醛，色谱纯，Sigma-Aldrich 公司；木聚糖酶(NS51024)、漆酶(OMN07015)，诺维信生物技术有限公司。

1.2 实验设备

YA28X－4T 型立式压力蒸汽灭菌器、HHS-21-4型电热恒温水浴锅、HHS-21-4 型高温高压反应釜，上海博讯有限公司；DKM610C 型电热鼓风干燥箱，日本雅马拓公司；SHB－III 型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸易有限公司；AR2140 型电子天平、STARTER3100 型酸度计，奥豪斯仪器(常州)有限公司；1200 series 型高效液相色谱仪，德国爱捷伦公司；FTIR-650 型傅立叶红外光谱分析仪，天津港东科技发展股份有限公司；SL-200PL 型移液枪，梅特勒·托利多仪器有限公司；T6 新世纪型紫外可见分光光度计，北京普析仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 预水解液组分分析

（1）单糖及糠醛含量的测定：量取10 mL PHL于50 mL 锥形瓶中，向其中加入378 μL 72%的硫酸进行酸化；用锡箔纸将锥形瓶进行封口，在高压蒸汽灭菌锅中将锥形瓶放置于最上层，覆盖牛皮纸；设定温度为121 ℃，时间为60 min，进行高压灭菌。灭菌的PHL 过0.22 μm 滤膜后用液相色谱仪测定。

（2）木素含量的测定：PHL 用去离子水稀释一定倍数后过0.22 μm 的滤膜，以去离子水作为空白组，用紫外分光光度计测定205 nm 波长处的吸收值（TAPPI，UM250）。根据式（1）计算木素含量。

式中：ε 为吸收系数，取110 L/(g·cm)；D 为稀释倍数；A 为吸光度；L 为1 cm 比色皿的厚度；w 为木素含量。

（3）标准曲线的绘制：

（a）葡萄糖、木糖、阿拉伯糖标准曲线的绘制方法：称取葡萄糖、木糖标准品各0.2 g，阿拉伯糖0.15 g放入离心管中，补加流动相至20 g，编号为B1，待完全溶解后进行浓度梯度稀释，稀释后的样品分别过0.22 μm 的滤膜，编号分别为B2、B3、…、B8，用液相分别测得其峰面积，以浓度(mg/g)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

（b）糠醛标准曲线的绘制方法：称取0.2 g 糠醛于离心管中，向离心管中补加流动相至20 g，编号为F1，摇匀后进行浓度梯度稀释，稀释后的样品分别过0.22 μm 的滤膜，编号分别为F2、F3、…、F8，用液相分别测得其峰面积，以浓度(mg/g)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，过程中注意遮光处理。

1.3.2 漆酶处理预水解液

（1）漆酶处理时间的确定：量取30 mL PHL 于50 mL 锥形瓶中，参考Wang 等[7]的研究，选用漆酶用量10 μL/mL 和温度36 ℃的实验条件，且在恒温摇床150 r/min 转速下分别处理0.5、1、2、3、4、5 h，然后灭活，过0.22 μm 的滤膜后待测，此时的预水解液记为L-PHL。

（2）木素去除率的测定：木素去除率根据式（2）计算。

式中：w 为原水解液木素的含量；w′为漆酶处理后水解液木素的含量。

（3）木素红外光谱分析：称取（0.001 0±0.000 2）g干燥后的漆酶处理后PHL 中析出的固体，加入（0.10±0.02）g 烘干的KBr，在玛瑙研钵中充分研磨后压片，空气为背景，在检测范围为400～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1条件下扫描样品。

1.3.3 木聚糖酶处理预水解液

通过初步实验确定了木聚糖酶对L-PHL 的作用条件。将L-PHL 转移至烧杯中，继续向其中加入2 mL 的木聚糖酶，在温度为70 ℃、转速150 r/min的条件下于恒温摇床中反应2 h，然后经灭活过0.22 μm 滤膜待测，此时的预水解液记为X-PHL。1.3.4 糠醛的制备

（1）取200 g 左右的X-PHL 于烧杯中，向其中加入98%的硫酸，使酸的质量分数为4%，混匀。

（2）在高压反应釜中加入约2/3 体积的（1）中的混匀水解液，设定温度为180 ℃，转速为90 r/min，最大压力15 MPa。

（3）等待仪器温度升到180 ℃开始保温，保温时间为90 min。

（4）保温结束后将温度调节至40 ℃，待降温结束后将仪器拆卸，转移液体至烧杯中，清洗仪器。

（5）用注射器吸取烧杯中液体，通过0.22 μm 滤膜，注射于液相小瓶中待测。

1.3.5 木糖转化率及糠醛得率的计算

L-PHL 经木聚糖酶处理后木糖转化率依据式（3）计算。

X-PHL 在硫酸催化作用下所制备的糠醛得率依据式（4）计算。

2 结果与分析

2.1 预水解液组分分析

根据标准曲线计算预水解液中各组分含量如表1所示。

表1 预水解液中各组分含量

2.2 漆酶处理预水解液

2.2.1 漆酶处理的最适时间

漆酶处理时间与木素去除率的关系如图1所示。由图1 可以看出：在酶用量、温度等因素确定的条件下，随着漆酶作用时间的变化，其对PHL 中木质素的诱导聚合去除效果愈加明显。作用时间达2 h 后木素去除效果基本不变，因此选取2 h 为漆酶作用PHL去除木素的最佳时间，此时的木素去除率达43%。

图1 漆酶处理时间与木素去除率的关系

2.2.2 漆酶处理前后PHL 中各组分的变化

漆酶处理前后PHL 中各组分含量变化如表2所示。由表2 可以看出：经过漆酶处理后，PHL 中木素的含量由4.14%下降到了2.36%，木素的去除率达到了43%，溶液中各糖组分的含量没有发生大幅度的变化，葡萄糖、木糖、糠醛的含量有小幅度的增加，而阿拉伯糖则略微减少。根据以上数据的分析，漆酶对PHL 中的木素有着选择吸附使得木素聚合的作用，这与Bourbonnais 等[8]的研究结果一致。

表2 漆酶处理前后PHL中各组分含量的变化

2.2.3 红外光谱分析

加入漆酶后烧杯中析出固体与加入木聚糖酶后析出固体的红外光谱图相似，所以只分析加入漆酶后析出固体的红外光谱图，见图2。

图2 木素的红外光谱图

由图2 木素的红外光谱图分析可知，3 429 cm-1是羟基的特征吸收峰；2 932 cm-1是—CH2—的特征吸收峰；1 542 cm-1、1 514 cm-1、1 422 cm-1为木素苯环骨架振动特征吸收峰；1 458 cm-1是CH3—O 的吸收峰；1 215 cm-1是木素结构中C—C、C—O、C=O 的振动吸收峰，以上吸收峰说明漆酶法处理预水解液后的析出固体为木素。

付时雨[9]和宋丽岩[10]经过对木素的红外光谱进行分析和比对得出结论，如果在制浆或者漂白的过程中出现了碳水化合物的氧化反应，则在光谱图的1 730 cm-1处出现吸收峰。而在本实验所得的光谱图里，在1 730 cm-1没有相关峰生成，这说明溶液中没有发生氧化反应，即漆酶除木素不会引起氧化反应的生成，并且从漆酶的作用机理进一步分析可知，相比PHL 中的其他组分漆酶对木素有选择吸附的作用，具有除木素的专一性。

2.3 木聚糖酶处理L-PHL

木聚糖酶处理前后预水解液组分的变化如表3所示。木聚糖酶处理L-PHL 只对其中糖类起作用，主要是L-PHL 中的单糖组分葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，对其他组分无明显效果，所以表3 中仅涉及相关单糖含量，尤其是木聚糖在木聚糖酶作用下降解成木糖的含量，以及后续实验中糠醛含量的变化。

表3 木聚糖酶处理前后预水解液各组分含量的变化

由表3 可以看出：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖的含量都增加了，其中葡萄糖增加最多，木糖和阿拉伯糖的增加率也达到了20%以上，而糠醛略微减少。糖含量的变化说明溶液中加入的木聚糖酶不仅作用于主链的β-1,4-糖苷键水解木聚糖分子，而且作用于木聚糖中阿拉伯糖侧链残基等，最终将木聚糖转化为它的组成单糖。

2.4 制备糠醛

经过在高压反应釜中的反应后，预水解液中各组分含量变化如表4所示。由表4 可以看出：反应后的糠醛含量大幅增加，阿拉伯糖含量有小幅增加，而葡萄糖含量略微降低，木糖含量大幅减少。由此可以得出结论，在以酸为催化剂时，溶液中的木糖大部分转化为糠醛，有一少部分会转化为阿拉伯糖。

表4 制备糠醛前后预水解液中各组分含量的变化

根据式（1）和式（2）计算可得：糠醛得率只有56.95%；木糖转化率较高，为89.8%。导致这种现象的原因可能有：当溶液中含有硫酸时，生成的糠醛可能会发生磺化反应，导致已经在溶液中的糠醛发生副反应，降低了糠醛的得率。Zeitsch[11]的研究也证实了这一点，硫酸会与溶液中生成的糠醛发生反应，使得实验结果中的得率较低。根据反应结果分析得到的糠醛转化率低的原因还可能是糠醛自身的降解反应。Williams 等[12]曾定量地分析了糠醛在硫酸作反应催化剂时损失反应的动力学，研究表明糠醛的降解率不仅与氢离子浓度成比例关系，而且反应温度和糠醛浓度都会对其造成影响，该降解反应为一级反应。

3 结论

（1）在本实验条件下用漆酶处理预水解液除木素，最佳的处理时间为2 h。

（2）木聚糖酶处理L-PHL 后，在硫酸催化作用下木糖的转化率为89.8%，糠醛的得率为56.95%。在漆酶/木聚糖酶双功能作用下，木糖未能全部转化为糠醛，可能有部分转化为了阿拉伯糖。