金属硫酸盐预处理增强小麦秸秆的酶解糖化特性

徐 双，王凯晴，霍 丹，付方伟，杨秋林,，张凤山

(1.中国轻工业造纸与生物质精炼重点实验室,天津市制浆造纸重点实验室，天津科技大学轻工科学与工程学院，天津300457；2.华泰集团华泰纸业有限公司，东营257335)

生物质是仅次于煤炭、石油和天然气的世界第四大能源，在整个能源系统中占有重要地位[1-2]。预处理、水解和发酵是生物质原料制备燃料乙醇的三个主要技术环节，通过预处理可以克服生物质原料水解时可发酵单糖得率偏低的问题，也能消除原料中的杂质对反应体系的影响[3]。因此寻找环保高效的预处理技术对生物质原料的后续转化至关重要。

目前，普遍认为生物质预处理具有如下作用：打破半纤维素和木素对纤维素的包裹和缠绕，改变植物细胞壁的物理化学特性；破坏引起纤维素结晶结构的氢键网络连接，降低其结晶度；去除部分半纤维素和木质素；增大生物质的疏松性，增加其比表面积和孔隙度；降低生物质的水解顽抗性，增加纤维素酶对纤维素的有效接触面积，提高酶解效率[4]。化学预处理是最常用的生物质预处理方法，主要包括酸预处理、碱预处理、氧化预处理、有机溶剂预处理和离子液体预处理等[5-8]。

除了上述化学预处理，金属盐预处理也能够有效提高固体基质的酶解糖化效率。金属盐预处理具有工艺简单、设备要求低、处理时间短、固体基质得率高、预处理液易分离等优点，是一种比较有前途的预处理技术。金属盐预处理主要是利用金属离子与木质纤维素之间的作用，即金属离子与木质纤维底物分子中羟基等络合，影响底物形态结构，从而影响其化学反应。此外，不同金属离子对纤维素酶活力会产生促进或抑制作用，从而影响生物质原料的酶解糖化效率[9]。目前，对于金属盐预处理的研究主要集中在金属氯盐，而对金属硫酸盐的研究较少。基于上述理论和研究现状，本文将金属硫酸盐用于生物质原料的预处理，以改善其后续酶解糖化效率。

1 原料与方法

1.1 实验材料

小麦秸秆取自河北辛集，经微型粉碎机（FZ102型，天津泰斯特仪器有限公司）粉碎后，取40～60 目组分备用。纤维素酶（Cellulast,50.97 FPU/mL）和纤维二糖酶（Novozyme188,1 290.69 CBU/mL）由诺维信北京公司提供。其他试剂均为分析纯，购买自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 金属硫酸盐预处理

准确称取绝干小麦秸秆20 g，置于高压反应釜（4566 型，美国Parr 公司）内，采用的固液比（质量比）为1∶6，金属硫酸盐K2SO4、Na2SO4、CaSO4、MgSO4、ZnSO4和FeSO4的加入量为0.15 mol/L，其他金属硫酸盐（Fe2(SO4)3、Al2(SO4)3、KAl（SO4）2）的加入量为0.05 mol/L。反应釜密封，调节转子转速为150 r/min，然后以5 °C/min 的升温速率升温到170 °C，预处理保温时间为25 min。预处理结束后，将反应釜迅速冷却至室温，进行卸锅操作。物料经80 目筛网过滤后，得到的液体即为预处理液。对于固体部分，采用1 L 去离子水充分洗涤，并用80 目筛网过滤，重复上述洗涤和过滤操作2 次，最终得到预处理后的固体基质。固体基质得率为固体基质与原料的质量比。

1.3 固体基质酶解糖化

准确称取2 g 固体基质，置于250 mL 锥形瓶中，加入一定量0.1 mol/L 的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液，然后加入10 FPU/g(对固体基质)的纤维素酶和15 CBU/g 的纤维二糖酶，并加入2 滴乙酸乙酯抑制水解过程中杂菌的产生，最后，用柠檬酸－柠檬酸钠溶液将固体基质浓度稀释到2.5%。将锥形瓶置于恒温培养振荡器(KYC－100B 型，天津欧诺仪器仪表有限公司)中，以150 r/min 的转速在50 °C 下反应48 h。反应结束后，将锥形瓶置于90 °C 的水浴中10 min，对酶进行灭活处理。最后，将酶解悬浮液采用真空过滤器分离，得到酶解液，酶解液进行还原糖含量检测，根据式（1）计算固体基质中纤维素的酶解转化率和单位质量小麦秸秆原料的葡萄糖产率。

式中：mg为酶解液中葡萄糖的质量，g；mc为酶解固体基质中纤维素的质量，g。

1.4 原料及固体基质分析

原料和固体基质的成分分析采用NREL 实验室的方法[10]。将0.3 g 样品依次进行浓酸解和稀酸水解，得到水解液和水解残渣。水解液采用高效液相色谱（HPLC，Agilent 1260 型，美国安捷伦科技公司）测定其单糖成分，用于计算纤维素和聚戊糖含量（木糖和阿拉伯糖含量之和），同时采用紫外－可见分光光度计（970894 型，瑞典Lorentzen &Wettre 公司）分析其酸溶木素含量。水解残渣用于分析样品的酸不溶木素含量。HPLC 检测条件为：色谱柱Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱温55 °C，流动相0.05 mol/L 硫酸，流速0.6 mL/min，进样量10 μL，采用RID 和VWD 检测器。

1.5 预处理液及酶解液分析

预处理液及酶解液在5 000 r/min 转速下离心10 min，将上清液用0.22 μm 水相微孔滤膜过滤后采用HPLC 进行成分分析，HPLC 检测条件见1.4。

2 结果与讨论

2.1 金属硫酸盐对小麦秸秆预处理及酶解糖化的影响

在小麦秸秆的预处理过程中，受金属离子化合价的影响，金属硫酸盐的加入量不同，但是体系中硫酸根离子的浓度保持一致（0.15 mol/L），其他预处理条件均相同。固体基质得率及酶解转化率见图1，固体基质的成分分析见表1。

图1 金属硫酸盐预处理对固体基质得率和酶解转化率的影响

表1 固体基质成分分析

尽管预处理洗涤过程会造成固体基质损失，但大部分固体基质损失是由金属硫酸盐预处理造成的。通过图1 发现，金属离子的化合价会影响金属硫酸盐对小麦秸秆原料的预处理效果。其中，一价金属硫酸盐预处理的固体基质得率最高，约为70%；二价金属硫酸盐预处理的固体基质得率为60%左右；而三价金属硫酸盐预处理的固体基质得率最低，采用Fe2（SO4）3时固体基质得率仅为52.5%。此外，复合盐KAl（SO4）2中既存在Al3＋又存在K＋，由于体系中这两种金属离子的含量均较低（0.075 mol/L），其在预处理中的效果较弱，所得固体基质的得率略低于一价金属硫酸盐。上述分析表明，金属离子的化合价越高，越有利于生物质原料的降解。这一规律在金属氯盐预处理的研究中已经得到证实，采用0.3 mol/L 的KCl 在160 ℃预处理桉木粉20 min，固体基质得率高达84.3%左右，而相同条件下0.1 mol/LFeCl3预处理的固体基质得率仅为63.6%[11]。此外，Liu 等[12]用氯盐KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2和FeCl3在180 ℃下对木糖和木聚三糖进行处理，结果也表明这几种金属氯盐都能促进木糖和木聚糖的降解，其促进降解的顺序依次为：FeCl3＞MgCl2＞CaCl2＞KCl＞NaCl，而且对木聚糖的降解作用比单糖更显著。

受原料结构特性影响，小麦秸秆直接酶解的转化率仅为14.8%。通过预处理可以脱除原料中的半纤维素和木素－碳水化合物复合体，从而改善细胞壁的纳孔结构（Nano-porous structures）分布，最终提高纤维素酶对生物质原料的可及度[13]。金属硫酸盐预处理可以显著提高小麦秸秆原料的酶解糖化效率，且其提高作用也严重受到金属离子化合价的影响。经一价金属硫酸盐预处理后，固体基质的酶解转化率仅为45%左右，二价金属硫酸盐预处理后固体基质的酶解转化率在60%左右，而三价金属硫酸盐预处理后固体基质的酶解转化率可达75%以上。需要指出的是，采用Fe2（SO4）3预处理后固体基质的酶解转化率高达88.3%，远高于三价盐Al2（SO4）3，这与采用Fe2（SO4）3预处理过程大量的半纤维素发生降解有一定的关系。此外，经过预处理后部分Fe3＋会吸附或螯合到固体基质表面，这些Fe3＋能够显著提高纤维素酶的活性，从而提高固体基质的酶解转化率[11]。

在对固体基质的成分分析（表1）中发现，固体基质中主要以纤维素为主，其含量超过50%。这是因为金属硫酸盐预处理主要导致原料中的半纤维素降解，而纤维素本身结构比较致密，存在结晶区，很难在预处理中被破坏。另外，预处理过程中金属硫酸盐为体系提供酸性环境，导致大部分的酸溶木素被降解溶出，而大部分酸不溶木素仍然保留在固体基质中。

2.2 金属硫酸盐预处理过程中木素及综纤维素的降解机制

为了明确预处理过程中原料中主要成分的降解规律，实验中对不同金属硫酸盐预处理过程中木素、纤维素和聚戊糖等的降解损失进行了统计，结果见图2 和图3。

图2 金属硫酸盐预处理过程中的木素损失

图3 金属硫酸盐预处理过程中的综纤维素损失

受预处理体系酸性环境的影响，原料中的酸溶木素较为容易溶出，而大部分酸不溶木素仍然保留在固体基质中（图2），其中一价金属硫酸盐预处理对酸溶和酸不溶木素的降解作用均较弱，而三价金属硫酸的降解作用则较强。聚戊糖为小麦秸秆原料中最主要的半纤维素成分。通过图3 可以发现，金属硫酸盐预处理主要导致大量半纤维素降解，而对纤维素的降解作用较弱。尽管一价金属硫酸盐在预处理中的作用较弱，原料中的聚戊糖损失也高达65%以上；而采用Fe2（SO4）3时，原料中聚戊糖的损失率达到最高水平，为91.8%，远高于一价和二价金属硫酸盐。对于纤维素的降解损失，采用一价金属硫酸盐预处理时纤维素的损失仅为10%左右；采用二价金属硫酸盐预处理时纤维素的降解损失略高于一价金属硫酸盐，为12%～13%；而三价金属硫酸预处理时纤维素的降解损失最大，高达16%以上。将固体基质的酶解转化率最终换算成单位质量小麦秸秆原料的葡萄糖转化率，结果见图4。尽管三价金属硫酸盐预处理导致大量的纤维素损失，但其固体基质酶解转化率（29.0%）远高于一价和二价金属硫酸盐，这也意味着原料中73.8%的纤维素已经转化为葡萄糖，最终导致小麦秸秆原料的葡萄糖产率也处于较高水平，即三价金属硫酸盐预处理更有利于提高生物质原料的酶解转化率。

图4 金属硫酸盐预处理对原料的葡萄糖产率影响

2.3 金属硫酸盐预处理液的分析及表征

预处理液中的葡萄糖主要和纤维素的降解反应有关，而木糖则为半纤维素的主要降解产物。此外，预处理过程中存在葡萄糖和木糖的副反应，葡萄糖副反应产物主要是5-羟甲基糠醛（5-HMF），5-HMF可进一步降解并产生乙酸，而木糖副反应的主要产物则为糠醛，糠醛可进一步分解产生甲酸[14]。为了进一步明确纤维素、半纤维素等在预处理过程中的降解反应，对预处理液中上述成分进行了分析检测，结果见表2。

表2 预处理液主要成分分析

由于预处理过程中主要导致半纤维素降解，因此预处理液中均存在大量的木糖，其中Fe2（SO4）3预处理的木糖含量最高（6.84 mg/mL）。此外，预处理液中存在少量的糠醛和甲酸，这说明有少量的木糖发生副反应，这与预处理时间较短有关（25 min）。由于纤维素的降解损失较少，预处理液中的葡萄糖含量也相对较低。其中，Fe2（SO4）3预处理的葡萄糖含量最高，为4.14 mg/L，与此对应，Fe2（SO4）3预处理过程中纤维素的降解损失最大。此外，所有预处理液中均存在较多的5-HMF 和乙酸，特别是乙酸，其含量普遍高于葡萄糖，这表明有相当一部分葡萄糖发生降解转化。

3 结论

金属硫酸盐预处理可以高效降解小麦秸秆中的半纤维素，提高所得固体基质的酶解糖化效率。相对于一价和二价金属硫酸盐，三价金属硫酸盐对原料中半纤维素(聚戊糖)和纤维素的降解作用更强，更有利于固体基质的酶解转化率。在预处理液中，大量的葡萄糖会进一步发生降解转化，而木糖则很少发生副反应。此外，预处理过程中少量金属离子会螯合或吸附到固体基质表面并影响酶的活性，从而影响固体基质的酶解糖化。