Vδ2 T细胞在2型糖尿病中的功能及临床研究*

陈 康，傅 强，卢建强，王伟佳

(广东省中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528403)

2型糖尿病是以血糖增高为特点的一种代谢紊乱性疾病。据报道，全国近5 000万人患有2型糖尿病，且预测在22世纪患病人数可达到6 000多万[1-2]。研究报道，初始免疫应答和适应性免疫应答参与2型糖尿病的发生、发展[3]。Vδ2 T细胞是具有抗原提呈功能，参与初始免疫应答的γδT细胞亚群，占γδT细胞的80%[4]。Vδ2 T细胞通过识别坏死细胞的非肽类抗原成分，释放炎性因子如白细胞介素(IL)-17和干扰素-γ(IFN-γ)，激活初始CD4+T细胞和CD8+T细胞转换为效应T细胞[5-7]。研究报道，Vδ2 T细胞可发挥感染免疫的作用[8-9]，参与脊柱关节炎的发生[10]，γδT细胞的数量在1型糖尿病患者体内降低，提示其与1型糖尿病的致病相关[11]。然而，Vδ2 T细胞在2型糖尿病中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨Vδ2 T细胞在2型糖尿病中的功能及与临床指标的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2019年6月来本院内分泌科就诊的40例2型糖尿病患者作为2型糖尿病组，其中男25例、女15例，平均年龄(55.5±14.7)岁。2型糖尿病的诊断符合世界卫生组织颁布的诊断标准，且患者未合并其他疾病。排除标准：恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性感染、急性并发症。收集同期本院体检的健康体检者35例为健康对照组，其中男16例、女19例，平均年龄(55.6±11.0)岁，两组间性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2流式细胞术检测Vδ2 T细胞亚群的比例 采用密度梯度离心法分离所有研究对象单个核细胞，裂解红细胞后，制备单个核细胞悬液，加入Pacific Blue标记的小鼠抗人CD3抗体(货号：558124，美国BD公司)和FITC标记的小鼠抗人Vδ2 TCR流式抗体(货号：562088，美国BD公司)，避光孵育30 min，FACSCanto Ⅱ进行流式检测，FlowJo软件进行结果分析。

1.3酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Vδ2 T细胞IL-17和IFN-γ的分泌 收集所有研究对象的单个核细胞，采用CD4+阴性磁珠分离试剂盒(货号：MAGH102，R&D 公司)去除CD4+T细胞，FACSAria流式分选出Vδ2 T细胞。将分选后的细胞铺入细胞培养板中，加入50 ng/mL波醇酯(PMA，货号：P1585，Sigma公司)和1 mg/mL离子霉素(ionomycin，货号：407953，Sigma公司)刺激6 h，收集细胞培养上清液，采用ELISA检测IL-17和IFN-γ的水平(货号：D1700和DIF50，R&D公司)。

1.4空腹血糖、空腹C肽和糖化血红蛋白的检测 收集两组的血清，采用西门子ADVIA2400生化分析仪检测空腹血糖；采用西门子CENTAUR XP生化分析仪检测空腹C肽的水平。收集两组乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血采用BIO-RAD糖化血红蛋白测定仪，检测糖化血红蛋白的水平。

1.5统计学处理 应用SPSS17.0统计分析软件进行数据分析，采用非配对t检验的方法分析两组之间的差异，采用Pearson进行相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组基本信息比较 2型糖尿病组中空腹血糖水平为(9.36±3.40)mmol/L，糖化血红蛋白水平为(8.32±2.25)%，均高出参考值范围；且2型糖尿病组的空腹血糖水平明显高于健康对照组[(4.95±0.35)mmol/L]，差异有统计学意义(P<0.001)；糖化血红蛋白水平明显高于健康对照组[(4.78±0.34)%]，差异有统计学意义(P<0.001)。2型糖尿病组空腹C肽水平为(1.42±0.9)ng/mL，在参考值范围内，但低于健康对照组[(1.76±0.38)ng/mL]，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A为代表性的流式细胞术的结果；B为Vδ2 T细胞比例的统计分析；*表示P<0.001。

图1 在2型糖尿病组和健康对照组中Vδ2 T细胞比例的差异

2.22型糖尿病组和健康对照组中Vδ2 T细胞比例的差异 结果显示，2型糖尿病组中Vδ2 T细胞比例为(0.20±0.28)%，明显低于健康对照组[(2.17±1.64)%]，差异有统计学意义(P<0.001)。以CD3标记淋巴细胞，Vδ2 TCR标记Vδ2 T细胞，流式细胞术的结果显示，在2型糖尿病组和健康对照组中，CD3和Vδ2 TCR双阳性细胞的比例分别为0.13%和3.20%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.3两组Vδ2 T细胞分泌细胞因子的情况 结果发现，相较于健康对照组，2型糖尿病组中Vδ2 T细胞比例明显下降，进一步用磁珠阴性分选法和流式细胞术分选法分选Vδ2 T细胞，用ELISA检测细胞因子IL-17和IFN-γ水平时发现，2型糖尿病组中Vδ2 T细胞分泌的IL-17和IFN-γ水平均低于健康对照组，见图2。

注：A为在2型糖尿病组和健康对照组中Vδ2 T细胞分泌IL-17的情况；B为在2型糖尿病组和健康对照组中Vδ2 T细胞分泌IFN-γ的情况；*表示P<0.01。

图2 两组Vδ2 T细胞分泌细胞因子的情况

2.4Vδ2 T细胞与空腹血糖、糖化血红蛋白和空腹C肽相关性分析 相关性分析发现，Vδ2 T细胞比例与空腹血糖水平呈负相关(r=—0.411，P<0.01)；与糖化血红蛋白水平呈负相关(r=—0.324，P<0.05)；进一步分析Vδ2 T细胞是否与患者的胰岛β细胞的功能相关，结果发现Vδ2 T细胞比例与空腹C肽水平无相关性(r=0.062，P>0.05)。

3 讨 论

2型糖尿病在全球普遍发病率高，且呈逐年增长的趋势[1-2]。2型糖尿病患者免疫功能紊乱是疾病发生、发展的重要原因[3]。Vδ2 T细胞是一类具有抗原提呈功能的T细胞亚群，是初始免疫应答和适应性免疫应答的桥梁，可发挥抗感染的作用，也可参与疾病的发生[4-11]。然而，Vδ2 T细胞在2型糖尿病中的作用未知。本研究发现，Vδ2 T细胞在2型糖尿病患者中数量减少，其细胞因子释放功能降低，且与空腹血糖和糖化血红蛋白水平呈负相关(r=-0.411,-0.324;P<0.05)。

T细胞分为两个主要的亚群，αβT细胞和γδT细胞。αβT细胞参与适应性免疫应答，主要包括CD4+T细胞和CD8+T细胞[12]。γδT细胞是初始免疫应答和适应性免疫应答的桥梁，其中Vδ2 T细胞占γδT细胞的80%[4]。研究报道，γδT细胞的数量在1型糖尿病患者体内降低，提示与1型糖尿病的致病相关[11]。在2型糖尿病中，T细胞的数量和功能紊乱，CD4+T细胞分化的促炎性的Th1细胞和Th17细胞以及抑炎性的Treg细胞和Th2细胞比例紊乱，导致患者系统炎症和胰岛素耐受[13-14]。CD8+T细胞通过诱导巨噬细胞的迁移促进疾病的发生[15]。而在2型糖尿病患者中Vδ2 T细胞的数量和功能如何变化鲜有报道。本研究发现在2型糖尿病患者中Vδ2 T细胞的数量减少，且其分泌的细胞因子IL-17和IFN-γ减少。研究报道，肥胖引起的慢性炎症中，Vδ2 T细胞释放的细胞因子IL-17减少，不能有效发挥抗感染的作用[16]。本研究发现，在2型糖尿病患者中Vδ2 T细胞数量减少，分泌的细胞因子IL-17和IFN-γ减少，这提示Vδ2 T细胞可能与2型糖尿病易于继发感染有关。

作为抗原提呈细胞，Vδ2 T细胞可在非肥胖糖尿病小鼠动物模型中识别胰岛素肽段B:9-23，释放IL-17和IFN-γ，促进1型糖尿病发病[17-18]。空腹C肽是反映胰岛β细胞功能的指标之一，相关性分析发现Vδ2 T细胞的比例与空腹C肽无相关性。这提示在2型糖尿病患者中Vδ2 T细胞数量与胰岛β细胞功能无相关性，究其原因可能是Vδ2 T细胞减少不能发挥有效的自身抗体识别功能。同样，本研究发现Vδ2 T细胞比例与空腹血糖和糖化血红蛋白水平呈负相关，这提示Vδ2 T细胞可能与2型糖尿病血糖控制情况相关。

4 结 论

本研究检测了2型糖尿病组和健康对照组Vδ2 T细胞的比例和功能并进行相关性分析，结果发现在2型糖尿病患者中Vδ2 T细胞比例减少，释放的细胞因子减少，且与空腹血糖和糖化血红蛋白水平呈负相关。