高通量自动化磁珠提取血凝块DNA的方法研究

潘亭亭 汪伟伟 吉栩

临床检验中血清样本使用后剩余的血凝块可以作为重要的样本资源重新回收、提取DNA进行利用，作为生物样本进行保存[1]，或者用来进行疾病诊断[2]或基因多态性和功能研究[3-5]。血凝块DNA提取的方法通常可以分为两个阶段：第一阶段通常是血凝块的匀浆或破碎，常见的方法包括使用手动或电动匀浆器、尼龙网挤压、剪刀剪碎、研磨棒研磨、加入钢珠搅拌等方式[6-8]，使血凝块从一整块分散成为悬浊液或者是尽可能小的小块；第二个阶段则是将分散后的血凝块样本采用不同的方法进行DNA提取，通常是各种血液DNA的提取方法或者是试剂盒，包括使用如酚/氯仿、高盐沉淀、各种商业化血液提取试剂盒等[6，9-11]。血凝块的匀浆、破碎可以增加样本与消化、裂解试剂的接触面积，有利于DNA释放。但是文献所述方法中的手工和匀浆设备等操作[2，6-7]，需要消耗大量的时间和人力，难以高通量同时处理大量样本，并且需要额外准备器械、适配的耗材等。或者是使用更复杂的试剂处理，试剂体积较大不适合常规自动化提取设备的要求[6-7]。为了实现自动化提取血凝块DNA，本研究采取流程简化、效率兼顾的思路，通过对适当大小的血凝块调整蛋白酶K用量、消化处理的温度和时间，结合常规血液DNA自动化提取使用的磁珠提取方式，建立高通量自动化的血凝块DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料和试剂 血凝块来源于生化检验后剩余的血凝块，采集时间为检验结束后1～2天，将血凝块冻存在-80℃备用。通用型血液/组织DNA磁珠法提取试剂盒购自长春志昂生物科技有限公司，蛋白酶K为试剂盒自带，浓度为20 mg/mL。提取过程中使用的无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。96孔深孔板购自苏州海狸生物医学工程有限公司。琼脂糖购自Biowest。50×TAE缓冲液购自Solarbio DNA Marker购自Takara公司。

1.1.2 仪器和器材 4℃冰箱购自中科美菱，金属浴、Kingfisher FLEX自动化核酸提取仪、16孔磁力架DynaMagTM-2、台式离心机Micro21R、Nanodrop 2000 c微量分光光度计购自美国Thermo Fisher公司，核酸电泳仪和水平电泳槽JY-SPCT购自北京君意东方电泳设备有限公司，凝胶成像仪购自英国UVItec公司，电子天平购自德国Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 血凝块处理和分割 冻存血凝块在4℃化冻后使用一次性吸管移去非抗凝采血管中的分离胶，转移血凝块至1.5 mL离心管，同时使用手术刀片将血凝块分割为约0.1～0.2 g的单个血凝块，称重记录处理前血凝块质量。在筛选优化条件阶段，使用6例血凝块样本，分成多份血块后按不同条件进行处理。

1.2.2 血凝块消化裂解 参考常规血液DNA提取时蛋白酶K用量，为每200～250 μL血液中加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL）。考虑到非抗凝血的凝固过程，0.1 g血凝块约来自于原200～250 μL全血，本研究中将每0.1 g血凝块使用20 μL蛋白酶K定义为1倍消化酶用量。蛋白酶K的用量分别为1倍（1×）和2倍（2×）两种条件，消化温度包括4℃、室温（23±1）℃和37℃。蛋白酶K消化后，加入提取试剂盒中的裂解液65℃加热裂解10分钟，10 000 rmp室温离心2分钟后吸取上清，转移至新1.5 mL离心管用于后续手工提取，或转移至96孔深孔板用于自动化提取。剩余的未消化血凝块称重，使用（原血块质量-剩余质量）/原质量×100%=血凝块的消化裂解率。不同条件下的消耗裂解率和常温下1倍蛋白酶K用量消化4小时的效率进行比较分析差异。

1.2.3 磁珠法DNA提取 根据磁珠提取试剂盒流程，在裂解液加入相应的磁珠进行吸附，再分别用洗涤液BW1和80%的乙醇按步骤进行清洗。在优化条件阶段使用16孔磁力架进行手工提取。选择优化条件后，对48个样品各两份，共96份样品使用核酸提取仪Kingfisher FLEX进行自动化提取，参考试剂盒常规设置，调整提取程序为如下步骤：裂解10分钟，磁珠结合吸附10分钟，BW1第一次清洗5分钟，BW1第二次清洗3分钟，80%乙醇第一次清洗3分钟，80%乙醇第二次清洗3分钟，晾干后洗脱10分钟。最后收集洗脱液转移至干净离心管中。

1.2.4 DNA质量分析 对提取所得的DNA用1%的琼脂糖电泳，观察提取所得的DNA的条带是否完整。用分光光度计分析浓度和纯度。使用Nanodrop 2000 c测定DNA的浓度，以及260 nm和280 nm下的光密度（OD）比值OD260/OD280。

1.2.5 统计和绘图 用SPSS 17.0软件分析统计实验数据，比较同样血凝块来源不同处理条件下的消化裂解效率时，采用配对t检验分析不同条件下消化裂解率的差异。对48例血凝块样本，通过Pearson相关性分析，分析同一样品两份血块之间提取结果的相关性。P＜0.05表示差异具有统计学意义。绘图使用GraphPad Prism 5.0。

2 结果

2.1 血凝块DNA提取条件的优化

2.1.1 不同蛋白酶K用量和温度下血凝块消化和裂解效率 将6例血凝块样本分成不同的血凝块小份，使每个小块大约为0.1～0.2 g，将各份置于不同处理条件下进行蛋白酶K消化和DNA裂解液处理，处理前后均对血凝块进行称重，通过（原血块质量-剩余质量）/原质量×100%计算不同酶量、时间、温度下的消化裂解效率。处理的条件为：4℃下1×蛋白酶K消化16小时（4-16 h-1×）、4℃下2×蛋白酶K消化4小时（4-4 h-2×）、4℃下2×蛋白酶K消化16小时（4-16 h-2×）；室温下1×蛋白酶K消化2小时（RT-2 h-1×）、室温下1×蛋白酶K消化4小时（RT-4 h-1×）、室温下2×蛋白酶K消化4小时（RT-4 h-2×）；37℃下2×蛋白酶K消化4小时（37-4 h-2×）。不同条件下的消化裂解率如图1A所示。将不同处理条件下的消化裂解率进行配对T检验，除4-16 h-2×、RT-4 h-1×、RT-4 h-2×和37-4 h-2×四个条件下的消化裂解率无差异外，其余条件下，差异具有统计学意义（P＜0.05）。如图1A所示，可见适当延长消化时间（4℃从4小时延长至16小时，室温下从2小时延长至4小时）、适当增加蛋白酶K用量（4℃下从1×用量增加至2×用量）可以提高消化裂解率，但对于室温下处理4小时，增加酶用量效果不显著。

从提取的DNA单位质量血凝块DNA产量和DNA总产量来看（图1B），4℃用1×蛋白酶K消化16小时的单位DNA产出量最高，同时也有较高的DNA总产出量，而4℃用2×蛋白酶K消化的两组和室温下用2×蛋白酶K消化4小时组虽然单位产量不高，但都有较高的DNA总产出量，这四组总DNA量差异无统计学意义。综合消化裂解率和DNA产量，4℃下进行消化和室温使用2×蛋白酶K消化4小时的效率较有优势。

2.1.2 处理温度和时间对DNA完整性的影响 从DNA电泳的结果可以看出（图1C），在4℃下消化血凝块提取的DNA基本完整，主带清晰，仅在消化16小时有个别样品出现极为轻微的降解。室温下，处理2小时得到的DNA也基本完整，但是处理4小时就出现了较为明显的降解带。在37℃处理时，样品出现了严重的降解。同时未观察到蛋白酶K浓度对DNA的降解有影响。因此，控制消化的温度和时间对获得完整的DNA有重要影响。

2.2 高通量自动化提取的效果

96份血凝块总体的平均消化裂解率都在70%以上，OD260/280平均值在1.70以上，基本符合预期1.7～1.9的参考范围。抽样电泳显示各样本条带完整，DNA基本无降解（图片未出示）。DNA的单位产量（每0.1 g血凝块产出DNA量）均值在4 μg左右，总量的均值在5 μg上下，均在预期范围内（表1）。对两份样品对应的参数进行相关性分析，除OD260/280之外消化裂解率、单位产量和总量均有相关性。两份样本消化裂解率相关性P值为0.004，相关系数0.409，而单位产量两份样本的相关系数为0.912，两份样本总量的相关系数为0.881，P值均小于0.001，说明对于同一例样本进行两次提取的结果非常相近，提取方法的可重复性好。

3 讨论

图1 不同处理条件下血凝块提取效果比较

表1 48例血凝块样本分两份提取效果的比较

本研究选择一种通用且简化的方式来实现高通量自动化提取血凝块DNA。虽然未对血凝块大小进行分析，但根据以往经验，较大的血凝块不利于处理，而且需要消耗更多的蛋白酶K、DNA裂解液等试剂。同时对血凝块中残留的血液进行提取，得到的DNA含量低，不能满足常规实验需求（结果未出示）。参考常规全血提取DNA需要的血液量，我们将单份提取的血凝块大小限制为约0.1～0.2 g。从消化裂解的效率看（图1A），2倍酶量相比1倍酶量对于较短处理时间的消化裂解率有提升，但在较长的处理时间下效率提升幅度较小。从DNA产出量来看（图1B），较长的消化时间有利于DNA的释放，较高的消化酶用量并不直接和更高的DNA产率相关，可能是相对过量的酶对于效率的提升作用有限，或是受DNA提取效率影响。在王琦等[10]的研究中发现，对于250 μL全血使用浓度为18.8～19.0 mg/mL的蛋白酶K效果最佳，因此可以根据实际工作和成本控制的需要，选择1～2倍之间的蛋白酶K进行消化。

从DNA的完整性来看，消化处理时的温度非常重要，37℃会造成DNA的严重降解，室温处理的时间也需要严格控制。其他研究中报道对牛血液、牛乳进行DNA提取时，4℃提取所得DNA质量优于室温提取[12-13]。结合本研究，4℃是血凝块提取的优选条件，如果选择室温下进行消化，建议控制时间在2小时左右。

根据文献中方法，匀浆器匀浆需要使用一次性耗材，否则容易导致样品的交叉污染[8]，增加了额外的耗材成本。在Mardan-Nik使用的方法中，在样品中放入金属的搅拌器材，并且使用了较大体积500 μL的提取试剂[7]，和常规的反应体系存在差异，这些参数和自动化设备的要求相冲突。本研究中蛋白酶K消化的操作属于极为普遍的操作，不需要特殊试剂和耗材，适用性好。消化时间也可以根据需要进行调整，即使需要4℃过夜消化，也不会额外增加对人力操作的需求。

以常见的Qiagen的DNA Blood Mini试剂盒为例，单次提取可从200 μL新鲜全血中得到4～12 μg的DNA，本研究从相当于200 μL左右全血的0.1 g血凝块中，平均可以获得的DNA约4 μg，提取效率和常规方法可以相比较。自动化提取的结果可以看到有一些样本的提取效率不高，这可能和样本初始的状态、个体的差异以及血凝块的不均一有关。但绝大部分单份样品可以得到0.5 μg以上的DNA，可满足常规单次全基因组测序的要求。值得注意的是有一些样品OD260/280稍微偏低，可能由于蛋白等杂质造成，因此目前的自动化提取程序还可以进一步优化以提高DNA的纯度。