快速制备鼻腔给予LPS诱导帕金森病动物模型及评价①

宋国斌 席国萍 李艳花 尉杰忠 刘春云 李凯军 柴 智 马媛媛 肖保国 张光先 马存根

(山西大同大学脑科学研究所,神经炎症变性疾病基础与应用研究山西省重点实验室，大同 037009)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)又名震颤麻痹，是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的第二大神经系统变性疾病，主要病理特征为黑质多巴胺能神经元变性、缺失，黑质多巴胺能神经元胞质内以α-突触核蛋白为主要成分的嗜酸性路易小体(lewy body，LB)的形成及黑质-纹状体通路以多巴胺(dopamine，DA)为代表的单胺类神经递质的减少[1-4]。研究表明，炎症在PD的发病中起重要作用，脑内小胶质细胞(microglia，MG)介导的炎症反应与PD存在重要联系[5-8]。脂多糖(lipopolysa-ccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，可通过激活MG来刺激机体产生炎症反应[9,10]。研究显示，LPS可通过黑质内注射、苍白球注射、纹状体注射和腹腔注射等途经引起黑质多巴胺能神经元缺失，制备PD动物模型[11,12]。LPS经鼻腔途径给予可诱导PD动物模型，但需时5个月[13]。本研究通过LPS经鼻腔小剂量、多次给药的方式，以期加快PD动物模型的制备，缩短PD发病机制及治疗效果的研究周期。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级健康雄性C57BL/6小鼠18只，6～7月龄，体质量30～33 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物实验遵照山西大同大学生物医学研究伦理审查委员会规定执行)。

1.1.2药物及试剂 LPS(Sigma公司)；兔抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗体(EMD Millipore公司)；兔抗α-突触核蛋白抗体、二抗Anti-rabbit IgG Alexa Flour 488(Cell Signaling Technology公司)；二抗HPR-goat anti-rabbit IgG(EARTH公司)；显影液ECL(Life Sciences公司)；辛基磺酸钠(octanesulfonic acid sodium salt，OSA)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)标准品、DA标准品、3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)标准品、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)标准品、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)标准品、高香草酸(homovanillic acid，HVA)标准品(Sigma公司)；OCT(Sakura Finetek公司)，NaH2PO4、乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)、柠檬酸、磷酸和高氯酸均为市售分析纯。

1.1.3仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(Agilent公司)；色谱柱Acclaim C18 column(2.2 μmol/L,2.1 × 100 mm)、酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；正置荧光显微镜(Olympus公司)；Bio-Rad凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司)；冰冻切片机(Leica公司)。

1.2方法

1.2.1动物处理与分组 小鼠单笼饲养，18～22℃自由饮食，并保持12 h/12 h昼夜循环，随机分为对照组和LPS模型组，每组9只。

1.2.2动物模型制备 LPS模型组小鼠鼻腔滴入LPS(3 mg/kg，生理盐水溶解)。滴入前先将小鼠用乙醚麻醉，保持小鼠头后仰，缓慢滴入LPS，保持后仰状态10～15 s，使LPS充分吸收。每侧鼻孔滴10 μl，1次/3 d，对照组鼻腔滴入等体积生理盐水，给药7周，共给药16次。

1.2.3行为学检测

1.2.3.1悬丝实验 参考文献[14-16]，长100 cm的金属丝水平固定于距离地面50 cm，小鼠两前爪抓住金属丝中心位置，按以下标准评分，评分越低代表小鼠肢体协调能力越差。①小鼠后爪抓住金属丝的时间评分：0～4 s、5～9 s、10～19 s、20～39 s、≥40 s 分别记5分、4分、3分、2分、1分；②小鼠爬到金属丝任意一端的时间评分：0～39 s、40～59 s、60～99 s、100～129 s、≥130 s分别记5分、4分、3分、2分、1分；③小鼠从金属丝掉下的时间评分：没有掉下、≥120 s掉下、60～119 s掉下、20～59 s掉下、<20 s掉下分别记5分、4分、3分、2分、1分。实验前训练5次，测3次，统计累积临床评分。

1.2.3.2爬杆实验 直角三角形装置，斜边为直径2 cm、长80 cm的圆形木杆，缠双层纱布，在斜边顶端固定一方形木块(以刚好容纳小鼠为标准)，斜边底端为平台。将小鼠置于斜边顶端，分别记录小鼠转头时间和小鼠爬到平台的时间。实验前训练5次，测3次，统计转头时间和爬到平台时间。

1.2.3.3步距实验 长50 cm、宽2.5 cm、高 20 cm的单向通道作为步距实验装置，通道底部铺白色硬纸，将小鼠的两后脚掌分别涂抹红蓝墨汁，放于通道入口，出口处设置暗室。实验前训练5次，测3次，统计通过通道的平均时间和平均步长。

1.2.3.4旷场实验 直径60 cm、高60 cm的圆形装置，设定外墙区、过渡区、内部中心区。通过电子成像系统记录并统计小鼠5 min内的运动距离、平均速度和休息时间[17]。

1.2.4标本采集 行为学实验之后，小鼠腹腔注射50 mg/L水合氯醛0.2 ml麻醉，生理盐水灌流。每组选6只小鼠左半脑黑质制备蛋白质匀浆，-80℃保存用于Western blot检测；右半脑黑质加入0.4 mol/L高氯酸溶液，超声匀浆、离心、制成单胺类神经递质样品液；每组剩余3只小鼠用4%多聚甲醛灌注固定，10%、20%、30%蔗糖溶液脱水，OCT包埋，小鼠黑质区冰冻切片140张(10 μm/片)，用于免疫荧光染色。

1.2.5免疫荧光染色检测小鼠黑质区TH+多巴胺能神经元 取黑质区冰冻切片7张(编号分别为20、40、60、80、100、120、140)，PBS洗3次，每次5 min，1% BSA-PBS溶液稀释抗TH一抗(1∶100)，4℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5 min，加入相应种属的二抗，室温避光孵育2 h，PBS洗3次，50%甘油封片。Olympus正置荧光显微镜观察抗体免疫染色活性并拍片。

1.2.6Western blot检测小鼠黑质区TH和α-突触核蛋白表达 黑质蛋白质匀浆浓度调成10 g/L，上样50 μg，SDS-PAGE垂直电泳1.5～2.0 h。 200 mA，1.5 h转PVDF膜，抗TH一抗、抗α-突触核蛋白一抗，4℃孵育过夜，TBST(含0.3%吐温的PBS溶液)洗 3次，每次5 min，辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，室温孵育2 h，TBST洗3次,ECL显影，Bio-Rad化学发光仪采集信号，Image lab 5.2进行图像灰度分析。

1.2.7HPLC检测小鼠黑质区神经递质含量 称取标准品NE 1.25 mg，E 1.56 mg，DOPAC 1.78 mg，DA 1.03 mg，5-HT 1.34 mg，5-HIAA 1.46 mg和HVA 1.03 mg分别溶于0.1 mol/L高氯酸，制成标准品储备液，-20℃保存，使用时稀释，绘制标准曲线。色谱条件：流动相：NaH2PO4(90 mmol/L)、柠檬酸(50 mmol/L)、OSA(1.7 mmol/L)、Na2·EDTA(25 μmol/L)、5%乙腈(V/V)混合液,0.22 μmol/L微孔滤膜过滤；流速0.2 ml/min；进样量10 μl；柱温40℃；Antec电化学检测器，电压0.7 V，灵敏度为50 nA。

2 结果

2.1鼻腔给予LPS导致小鼠肢体协调能力降低 鼻腔给予LPS第3周开始，通过悬丝实验累积评分评估小鼠肢体协调能力。实验结果显示：3～7周，对照组小鼠悬丝实验累积评分处于相对稳定水平，LPS模型组随给药时间延长，累积评分逐渐降低，4～5周缓慢降低，6～7周急剧降低(P<0.001，图1)。给药7周后，LPS模型组累积评分(9.57±1.98)较对照组(12.38±1.53)显著降低。

2.2鼻腔给予LPS导致小鼠运动能力减弱 悬丝实验表明，给药7周后，与对照组相比，LPS模型组肢体协调能力明显减弱。爬杆实验中，LPS模型组小鼠转头时间较对照组明显延长(P<0.001)，到达平台时间较对照组明显延长(P<0.001)。步距实验中，LPS模型组小鼠平均步长较对照组明显缩短(P<0.001)，通过通道的时间较对照组明显增加(P<0.001)。旷场实验中，LPS模型组小鼠总运动距离较对照组明显减少(P<0.01)，平均速度较对照组明显减慢(P<0.001)，休息时间较对照组明显增加(P<0.01，图2)。

2.3鼻腔给予LPS诱导黑质区TH神经元变性缺失 黑质区TH免疫荧光染色结果表明，与对照组比较，LPS模型组小鼠黑质区TH阳性多巴胺能神经元数量较少(P<0.05，图3)。

2.4鼻腔给予LPS诱导黑质区TH表达减少及α-突触核蛋白表达增加 与对照组比较，LPS模型组小鼠黑质区酪氨酸羟化酶表达减少(P<0.05)，与对照组比较，α-突触核蛋白表达增加(P<0.05，图4)。

2.5鼻腔给予LPS诱导黑质区神经递质及代谢产物减少 与对照组相比，LPS模型组小鼠黑质区神经递质DA浓度降低(P<0.05)，DOPAC浓度降低(P<0.05)，HVA浓度降低(P<0.05)，NE浓度降低(P<0.05)，5-HT浓度降低(P<0.05)，5-HIAA浓度降低(P<0.05,图5)。

图1 小鼠肢体协调能力比较(0～7周) Fig.1 Comparison of body coordination ability of mice(0-7 weeks)Note: Compared with control group，***. P<0.001.

图2 小鼠运动功能比较Fig.2 Comparison of motor function of miceNote: Compared with control group,**.P<0.01,***.P<0.001.

图3 小鼠黑质区TH+多巴胺能神经元比较Fig.3 Comparison of TH+ dopaminergic neurons in substantia nigra of miceNote: Compared with control group，*.P<0.05.

图4 小鼠黑质区TH和α-突触核蛋白比较Fig.4 Comparison of TH and α-synuclein in substantia nigra of miceNote: Compared with control group，*.P<0.05.

图5 小鼠黑质区神经递质比较Fig.5 Comparison of neurotransmitters in substantia nigra of miceNote: Compared with control group，*.P<0.05.

3 讨论

目前，常用的PD动物模型主要是通过神经毒素(如6-羟基多巴胺、MPTP、鱼藤酮等)诱导的神经毒素模型，给药方式通常为腹腔注射、皮下注射或脑内定点注射，但具有局限性，如6-羟多巴胺不能通过血脑屏障，脑内定点注射对脑部产生机械性损害，MPTP本身自然界不存在，且多为急性或亚急性模型，不能模拟PD渐进性发病特点，鱼藤酮模型对不同动物个体制备效果不一，重复性差。为深入研究PD的发病机制和治疗方法、改善PD患者的生活质量，构建能模拟PD渐进性发病过程、行为学特征、病理学特征的理想动物模型尤为重要[13,18-20]。

环境因素作为PD诱因之一，其机制可能是环境毒物通过口服或鼻腔暴露[13]。LPS在自然界广泛存在，可见于空气尘埃、大气污染源所含的细颗粒物，故人类经常暴露在LPS中，可经鼻直接进入脑内[21-23]。而作为内毒素的LPS，虽然对神经元无直接毒性，但可激活脑内MG，诱导免疫反应，释放大量的细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β等)和神经毒性因子(ROS、RNS等)，导致黑质-纹状体通路损坏，出现PD症状[24-27]。研究显示，脑内注射大剂量LPS，可迅速激活MG，通过炎症反应介导PD发生，但立体定向注射难度大且大剂量注射不符合PD发病的渐进性特征，通过腹腔注射LPS也能诱导PD模型，但会引起炎症反应和肝肾功能损害[11，28，29]。经鼻暴露LPS可导致嗅觉神经元缺失，与早期PD患者嗅觉减退现象相吻合，表明经鼻暴露LPS可能是制备PD动物模型的潜在途径[30]。

本研究通过小剂量、多次滴鼻给予LPS的方式，作用于C57BL/6小鼠诱导PD动物模型。给药7周后，行为学实验显示，LPS模型组小鼠肢体协调能力、步距、动作灵敏度等运动功能较对照组均明显下降，LPS滴鼻7周后，病理学显示黑质多巴胺能神经元数量明显减少、TH表达明显降低、α-突触核蛋白的表达显著增加、神经递质含量明显减少，成功建立了符合行为学及病理学特征的PD小鼠模型。这一研究结果与He等[13]采用LPS(0.5 mg/kg)隔天滴鼻，连续5个月造模的研究结果相似，但用时更短，实用性更强，可更加快捷地用于PD发病机制、病理学变化、神经递质变化及治疗方法、治疗效果的研究。