人类肝脏NK细胞与肝脏疾病①

程 明 孙 汭 田志刚 彭 慧

(中国科学技术大学免疫学研究所，合肥 230027)

肝脏是人体的代谢器官，在调节脂肪、糖类及碳水化合物的代谢平衡中发挥重要作用。肝脏稳态的维持和生理功能的正常行使依赖于免疫系统的精细调控[1]。肝脏具有独特的供血机制，其80%左右的血液供应来源于门静脉，其中来自于胃肠道的食物抗原、微生物及生物毒素等，使肝脏暴露于大量外来抗原之中[2]。一方面，肝脏需要识别有害抗原并引起适度的免疫反应以清除有害抗原；另一方面，需要对食物抗原等无害物质保持免疫耐受，避免产生过激的免疫反应。这种免疫平衡的建立依赖于各类固有免疫和适应性免疫细胞的参与。肝脏含有大量固有免疫细胞，包括巨噬细胞、自然杀伤T(natural killer T,NKT)细胞和自然杀伤(natural killer,NK)细胞等[3]。NK细胞在肝脏免疫中扮演重要角色，可通过天然杀伤和分泌细胞因子控制病毒感染和肿瘤的发生发展[4]。近来研究表明人类肝脏NK细胞和外周循环NK细胞之间存在诸多差异，本文回顾了人类NK细胞的基本生物学特性、NK细胞的肝脏区域免疫特征及其在不同肝脏疾病发生发展过程中所产生的影响。

1 人类NK细胞的基本生物学特征

1.1NK细胞的表型与功能 人类NK细胞是以CD3-CD56+为标志的大颗粒淋巴细胞[5]。CD56也被称为神经细胞黏附分子，表达于人NK细胞和部分T细胞上[6]。小鼠NK细胞不表达CD56，自然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptor，NCR)家族成员NKp46是鉴别小鼠NK细胞的特异性标志[7]。然而人类CD3-CD56+NK细胞低表达或不表达NKp46，提示NKp46不能作为人类与小鼠NK细胞的共同表征分子[6]，对于跨种系NK细胞表面共同标志物的鉴定有待进一步探索。

NK细胞作为免疫系统的重要组成部分，在对抗病原体感染和肿瘤免疫监视中担任着哨兵和前线防御者的角色。与T、B细胞不同，NK细胞不表达基因重排的抗原特异性受体，而是依赖一系列种系基因编码的受体。NK细胞表面活化性受体(NKp46，NKp44、NKp30、NKG2D等)或抑制性受体(NKG2A、TIGIT、人抑制性KIR、小鼠Ly49受体等)与靶细胞上的相应配体结合，从而传递活化或抑制信号，二者之间的信号平衡决定NK细胞能否被活化[8，9]。正常组织细胞由于高表达MHCⅠ类分子，可与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族抑制性受体结合，传递抑制信号，从而免受NK细胞攻击；而感染或转化的细胞通常下调表达MHCⅠ类分子，尽管可以因此逃避MHCⅠ限制性T细胞的识别，但可减弱MHCⅠ类分子和NK细胞抑制性受体结合传递的抑制信号，使NK细胞激活并杀伤感染或转化的细胞[10]。此外，NK细胞功能也受到细胞因子的调控，IFN-α/β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IFN-γ可启动NK细胞活化，而TGF-β、IL-10则可抑制NK细胞功能[11]。

NK细胞活化后可释放穿孔素和颗粒酶等毒性物质导致靶细胞裂解，也可通过表达凋亡相关受体的配体(Fasl、TRAIL、TNF)与靶细胞表面的DR5、Fas/CD95、TNF受体1等分子相结合，进而激活靶细胞的凋亡程序[12]。活化的NK细胞还能分泌包括IFN-γ在内的多种细胞因子参与免疫调节[13]。

1.2人类NK细胞的早期发育 T、B细胞发育分化的研究已被广泛报道，而对于人类NK细胞早期发育阶段还知之甚少。传统观点认为NK细胞来源于骨髓，骨髓基质细胞提供造血干细胞向NK细胞发育所必需的细胞因子[14-16]。近来研究发现在淋巴结、胸腺及肝脏中存在具有NK细胞分化潜能的早期淋巴祖细胞，提示这些器官可能是部分NK细胞髓外发育分化的场所[17-19]。

NK细胞起源于造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)，Lin-CD34+HSC向CD45RA+淋巴诱导多潜能祖细胞分化(lymphoid-primed multipotential progenitor，LMPP)[20]。在获得CD38、CD7、CD10和细胞因子受体CD127(IL-7受体-α)的表达后，LMPP转变为共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitor，CLP)。CLP具有向Pro-B、Pre-T、NK祖细胞(NK cell progenitor，NKP)或其他固有淋巴细胞谱系发育的潜能，代表着淋巴细胞分化早期的关键分支点[21]。IL-15是NK细胞发育依赖的细胞因子，早期研究通过小鼠模型发现，细胞因子受体CD122(IL-2/IL-15Rβ)是NK细胞谱系发育的标志分子[22]，但近来在人的骨髓、脐带血、扁桃体和胎儿组织中发现，Lin-CD34+CD38+CD123-CD45RA+CD7+CD10+CD127-NKP可以定向发育成NK细胞，与小鼠rNKP不同的是，这群细胞几乎不表达CD122，但在体外特定细胞因子的诱导下能上调CD122的表达，提示在NKP向NK细胞分化过程中对IL-15的响应可能需要环境因素的启动[21]。NKP进一步获得CD56的表达象征着成熟NK细胞的产生[6]。

1.3NK细胞的亚群及分布 根据CD56分子的表达将人类NK细胞分为CD56bright和CD56dim两个亚群，它们具有不同的表型、定位和免疫功能。CD56brightNK细胞主要分布于次级淋巴组织和某些实体器官，高表达CD62L与趋化因子受体CCR7，这些分子介导淋巴细胞迁移与归巢，可能对该亚群在体内的分布具有重要意义，而CD56dimNK细胞缺乏这些分子的表达[23,24]。另外，两个亚群在功能性受体的表达上存在差异，CD56brightNK细胞高表达NKG2A/CD94等抑制性受体，低表达KIR与FcγRⅢ(CD16)，而上述分子在CD56dimNK细胞上的表达模式与此相反[25,26]。此外，CD56brightNK细胞的细胞因子分泌能力较强，可产生高水平的IFN-γ与GM-CSF等细胞因子。体外实验表明，不同环境因素诱导下，CD56brightNK细胞偏好分泌不同类型的细胞因子，例如，IL-12和IL-18联合刺激诱导CD56brightNK细胞产生IFN-γ、IL-15和IL-18刺激,诱导其产生GM-CSF，而IL-12和IL-15导致其分泌高水平的IL-10[23]。外周血中NK细胞以CD56dim亚群为主，该群体分泌细胞因子能力较弱而高表达FcγRⅢ，其通过含有免疫受体酪氨酸激活基序的相关亚基与抗体Fc段结合，介导抗体依赖的细胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)[27]。

目前关于CD56bright和CD56dimNK细胞是否代表两个功能亚群，亦或处于NK细胞的不同发育阶段仍有争议。有观点认为CD56brightNK细胞是CD56dimNK细胞的前体，且已找到介于这两群细胞的中间细胞亚群[28,29]。然而，体外实验证明CD56dimNK细胞可向CD56brightNK细胞转化[30]，且最近的研究提示这两群细胞为终末分化细胞并来源于不同前体[31,32]。因此，关于这两群细胞在发育路径上的相关性仍需进一步研究。考虑到NK细胞表面标志物的表达易受环境因素影响而产生波动，根据单一表面标志物对NK细胞进行亚群划分可能并不准确。

此外，根据CD27与CD11b的表达可将小鼠NK细胞成熟过程划分为四个阶段，其中双阴性(CD27-CD11b-)NK细胞依次经历CD27+CD11b-、CD27+CD11b+阶段成为终末成熟的CD27-CD11b+NK细胞[33,34]；人类NK细胞也可基于CD27与CD11b的表达分为不同亚群，各亚群具有独特的功能，与CD56brightNK细胞相似，CD27+CD11b+/-NK细胞具有较强细胞因子分泌能力，CD27-CD11b+NK细胞与CD56dimNK细胞相似，展现出较高的细胞毒活性，而CD27-CD11b-NK细胞表现出不成熟的表型[35]。同时，与CD27+CD11b+NK细胞相比，CD27-CD11b+NK细胞产生IFN-γ的能力下降，提示NK细胞功能在成熟过程中受到调控[36]。NK细胞成熟过程伴随多个表面分子上调或下调表达，某一组特定表面标志物所定义的NK细胞发育阶段往往与其他表面分子所定义的NK细胞亚群发生重叠，关于不同亚群之间存在的联系有待进一步探索。

2 肝脏NK细胞

2.1人类肝脏NK细胞基本特性 20世纪70年代大鼠肝脏NK细胞首次被描述为pit细胞，其直径介于淋巴细胞与粒细胞之间，形状不规则且多变[37]。早期研究表明，肝脏NK细胞与外周血NK细胞在表面分子表达、细胞因子分泌能力及细胞毒活性等方面存在差异[38]。例如，肝脏NK细胞低表达成熟相关的自身主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子的抑制性受体，高表达组织驻留标志CD69[39]。此外，NK细胞在人体循环淋巴细胞中占5%～15%[28]，但占人类肝脏淋巴细胞数目的50%[40]。肝脏NK细胞的相对丰富性和独特特征提示其对于肝脏稳态维持可能具有重要意义[41]。

人类肝脏两个主要NK细胞亚群CD56bright和CD56dimNK细胞比例相近，肝脏CD56dimNK细胞与外周血CD56dimNK细胞有较多共同的表型和功能特征，包括CD16、KIRs和细胞毒效应分子的表达[39,42]。而肝脏CD56brightNK细胞在表面分子表达上与外周血CD56brightNK细胞有所不同，其组成性表达组织驻留标志CD69与趋化因子受体CCR5、CXCR6，这种独特的趋化因子受体表达谱可能对其选择性定位于肝窦至关重要[43]。

2.2人类肝脏驻留NK细胞的发现 最近研究表明，肝脏NK细胞是异质性群体，根据其迁移能力，人类与小鼠肝脏NK细胞可分为经典NK(conventional NK,cNK)细胞与肝脏驻留NK(liver-resident NK,LrNK)细胞，前者通过血液循环在组织间迁移，而后者则保持组织驻留特性，二者在表型及功能分子表达上均存在显著区别[40]。目前对于小鼠LrNK细胞和cNK细胞亚群的表型区分比较明确，根据细胞表面CD49a和CD49b (DX5)的表达差异可以将小鼠肝脏NK细胞分为两个亚群：CD49a-CD49b+cNK细胞和CD49a+CD49b-LrNK细胞[44]。小鼠LrNK细胞约占肝脏NK细胞的50%，其高表达CD69、TRAIL、CXCR6等组织驻留标志[44]。

人类LrNK细胞的表型特征与鼠中不完全相同，早期研究发现人类肝脏中存在CD3-CD56+CD49a+CD56brightNK细胞具有肝脏驻留特性，这群细胞转录因子的表达与小鼠LrNK细胞相似，高表达T-bet低表达Eomes，但其在不同个体间的表达差异较大，且在肝脏NK细胞中占比很小[42]。最近发现CXCR6+或CD49e-NK细胞在人体肝脏中高度富集，但它们在外周循环NK细胞中占比很低，提示CXCR6和CD49e可能是区别人类LrNK细胞和cNK细胞的潜在标志物；在转录因子表达方面，人类循环NK细胞高表达T-bet低表达Eomes，而肝脏CXCR6+或CD49e-NK细胞低表达T-bet，而高表达Eomes[45-48](图1)。这些结果提示人类LrNK细胞可能是由不同表型特征的细胞亚群组成的异质性群体，其中部分表型分子在不同亚群重叠表达，有关人类肝脏驻留NK细胞的研究有待进一步展开。目前关于不同NK细胞亚群之间的谱系关系及其在肝脏疾病进程中的影响成为研究热点[42,44]。

2.3人类肝脏ILC概述及其与NK细胞的关系 固有淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)家族是高度异质性的细胞群体[49]。根据产生Th1型、Th2型和Th17细胞相关细胞因子的能力和转录因子表达特点，可将ILC分为三大类：1型ILC(group 1 ILC)，其表达转录因子T-bet并产生Th1型细胞因子IFN-γ， 包括cNK细胞，组织驻留NK细胞和ILC1；2型ILC(group 2 ILC)即ILC2，其产生Th2相关细胞因子，包括IL-5和IL-13并表达转录因子Bcl11b、Gata3及Rorα；3型ILC(group 3 ILC)，其与Th17细胞有相同的特征，包括转录因子Ahr和Rorγt的表达以及IL-17和IL-22的产生，主要包括ILC3和淋巴组织诱导(LTi)细胞[50]。稳态下肝脏中存在的ILC主要为1型ILC，几乎占所有ILC的95%， ILC2和ILC3数量较少，仅占所有ILC的5%[51]，关于不同ILC亚群在肝脏疾病中的功能研究已引起广泛关注[52-54]。目前小鼠ILC发育路径的研究较为系统，主流观点认为ILC成员都起源于CLP[55]，在Nfil3(E4bp4)调控下，CLP进一步发育成为共同ILC前体(common innate lymphoid progenitors，CILP)，CILP在不同转录因子的引导下形成不同的发育路径。其中，在Ets1和Eomes的调控下诱导CILP分化为cNK细胞；而Id2和Gata3的活化则会使CILP进入另一条发育路径，形成共同辅助固有淋巴样细胞前体(common helper innate lymphoid progenitor，CHILP) 。在T-bet等转录因子作用下，PLZF+的 CHILP会最终发育形成包括ILC1在内的各个ILC亚群[56]，但不能发育为cNK细胞。

图1 人类肝脏NK细胞亚群的表型及功能Fig.1 Phenotype and function of human liver NK cell subsetsNote:Human liver NK cells contain cNK cells and LrNK cells.cNK cells express CD49e and circulate through the blood.In contrast,LrNK cells express CXCR6,CD69 and other tissue-resident molecules,but lack CD49e expression,and do not participate in blood circulation.LrNK cells and cNK cells also differ in expression of effector molecules and transcription factors.

目前，ILC1的界定较为模糊，与NK细胞亚群存在重叠。ILC1最初以功能特点来定义，用来描述能分泌IFN-γ但不具备细胞毒作用的ILC，与Th1细胞相似。近年来对ILC亚群发育源头的追踪研究发现，小鼠ILC1由CHILP发育而来，且不依赖转录因子Eomes[13]；而NK细胞兼具IFN-γ分泌能力和杀伤功能，是CD8+T细胞在固有免疫中的对应组分，其发育依赖转录因子Eomes[57]。然而，目前尚无特定表型分子或转录因子能将1型ILC中不具备细胞毒作用的群体区分出来。在功能上，LrNK细胞尽管和cNK细胞相似，具有较强的杀伤功能[40]，但LrNK细胞在发育路径上与cNK细胞不同，与黏膜ILC1相似，其发育依赖T-bet而不依赖Eomes，因此LrNK细胞也被称作肝脏ILC1[56]。人类中有两个ILC1亚群已被报道：①在扁桃体和肠上皮中发现的CD103+上皮内ILC1(intraepithelial ILC1，ieILC1)[58]；②产生IFN-γ但缺乏细胞杀伤功能的CD127+ILC1[59]。其中CD127+ILC1与CD56brightNK细胞均表达CXCR3、CD127等表面分子。另外通过转录组学和表观遗传学研究比较循环NK细胞和ieILC1发现， CD56dim细胞与CD56bright细胞几乎没有关联，而CD56bright细胞与ieILC1存在一定的亲缘关系[57]。因此，人类ILC1可能并不代表与NK细胞完全不同的谱系，而是具备某种特定功能状态的细胞亚群(例如分泌IFN-γ)。

尽管目前普遍认为ILC1与cNK细胞在发育谱系上不同，但近来研究发现肿瘤微环境高水平的TGF-β促进CD49a-CD49b+Eomes+cNK细胞转变为CD49a+CD49b-EomesintILC1最终导致肿瘤细胞的免疫逃逸[60]，提示在特定环境下cNK细胞可转变为ILC1，因此，ILC1与cNK细胞究竟是两个完全独立的细胞亚群还是不同环境下呈现的不同状态，这仍有待进一步研究。

3 肝脏NK细胞与肝脏疾病

大量研究表明NK细胞对于肝脏的免疫防御和疾病控制至关重要。一方面NK细胞在抗病毒感染、延缓肝纤维化进程和抑制肿瘤细胞生长中对机体发挥有利作用，另一方面也能导致肝细胞损伤，并负调适应性免疫系统抗病毒应答，从而对机体产生不利影响。

3.1病毒性肝炎

3.1.1乙型肝炎病毒感染 全世界约有2.4亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)[61,62]。HBV感染可导致多种肝脏疾病，如急性自限性肝炎、暴发性肝炎伴肝功能衰竭、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌[61,63]。尽管适应性免疫反应被认为是决定HBV感染进程的关键因素[64]，但在HBV感染的早期或免疫清除阶段，NK细胞表现出活化的表型和增强的效应功能[65,66]，且NK细胞来源的IFN-γ可有效阻止HBV的持续感染[67]，说明在感染早期NK细胞对于疾病控制至关重要。值得注意的是，激活的NK细胞在抗病毒过程中可能造成肝脏损伤[65]。NK细胞履行其作为固有免疫细胞职责的同时，也参与调节适应性免疫应答。HBV感染小鼠模型中，肝脏NK细胞通过分泌IFN-γ来介导CD8+T细胞的活化，且发挥这一作用的主要是cNK细胞，而NKG2A+LrNK细胞可能对cNK细胞IFN-γ的分泌起抑制作用[68,69]。这提示IFN-γ对于NK细胞抗病毒非常重要，其既可以直接抑制HBV复制[70]，又可以激活适应性免疫系统从而控制疾病发展。然而，HBV患者外周血抑制性单核细胞通过PD-L1/HLA-E分别与NK细胞上PD-1/CD94相互作用诱导产生调节性NK细胞，其分泌IL-10抑制适应性免疫应答[71]。此外，NK细胞还能通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的信号通路来调节病毒特异性CD8+T 细胞，表达TRAIL死亡受体2(TRAIL-R2)的HBV特异性CD8+T细胞与NK细胞表面TRAIL相互作用，导致病毒特异性CD8+T细胞凋亡[72,73]。由于LrNK细胞组成性高表达TRAIL[74]，提示LrNK细胞可能是通过TRAIL信号负调T细胞功能的主要因素。

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者体内，NK细胞上调表达抑制性受体，下调表达活化性受体，因而处于功能低下的状态。Siglec-9作为一种MHCⅠ类分子非依赖的抑制性受体，选择性表达于CD56dimNK细胞，CHB患者肝细胞上Siglec-9配体表达上调，增强NK细胞抑制性信号，使NK细胞分泌细胞因子能力降低，通过抗体阻断Siglec-9信号通路增强NK细胞效应功能可能有助于控制HBV感染[75]。另外CHB患者外周血NK细胞高表达NKG2A，处于免疫抑制状态。通过HBV小鼠模型对此现象进行探索发现，小鼠肝脏调节性CD4+T细胞分泌的IL-10可诱导NK细胞表达NKG2A，阻断NKG2A可以逆转NK细胞的耐受状态，增强其细胞毒作用，进而促进HBV清除，相同现象在人类NK细胞上也得到验证[76，77]。此外，CHB患者体内高水平的TGF-β导致NK细胞上活化性受体NKG2D、2B4表达下调，NK细胞杀伤活性减弱[78]。这些结果说明CHB患者体内免疫抑制性细胞因子对于NK细胞的表型及功能具有塑造作用，并且针对NK细胞高表达的抑制性受体使用相应抗体阻断可以有效逆转NK细胞的抑制状态从而控制疾病的发展。

在CHB感染中，不同的NK细胞亚群所起的作用可能并不相同，产生IFN-γ的NK细胞限制了病毒感染，而偏向于细胞毒功能的NK细胞一方面杀伤感染细胞延缓疾病进程，但同时可能加重肝脏损伤和限制抗病毒T细胞反应来加速疾病进展。此外，在慢性HBV感染过程中，NK细胞上调表达相关抑制性受体表现出功能低下的状态，这是否是为了平衡NK细胞可能造成肝脏损伤的一种补偿措施，这些受体的表达变化是具有亚群特异性还是普遍发生的现象依然有待探索。

3.1.2丙型肝炎病毒感染 全世界超过1.85亿人为丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,HCV)慢性感染患者[79]。在HCV感染过程中，只有15%～20%的成人自发清除病毒，大部分发展为慢性感染患者，其中一部分感染患者进一步发展为肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[80]。NK细胞对于HCV感染的控制同样重要，早期研究证实，编码 NK细胞抑制性受体KIR2DL3及其配体HLA-C1的基因与HCV感染的自发缓解有关[81]。这种现象的一个可能解释是KIR2DL3与HLA-C1相互作用介导的NK细胞抑制可能比其他KIR-HLA所介导的抑制作用弱。而KIRs家族的活化性受体KIR3DS1分子与配体HLA-F结合后可以激活NK细胞的功能。在HCV感染者原代肝组织中，HLA-F在HCV感染细胞表达上调，体外实验证实KIR3DS1+NK细胞相较于KIR3DS1-NK细胞展示出更强的抑制HCV复制的能力，提示KIR3DS1和HLA-F之间的相互作用有助于NK细胞控制HCV感染[82]。上述研究说明KIRs及其HLA配体的表达模式影响NK细胞抵抗HCV感染的能力。

NK细胞在HCV感染的急性期被激活，其活化性受体NKG2D表达上调，IFN-γ分泌能力和细胞毒作用增强，从而杀伤HCV感染的肝细胞[83]。而在慢性HCV患者中，NK细胞展现出功能上的二分法：增强的细胞毒效应及减弱的细胞因子分泌能力[84]。慢性HCV感染阶段，NK细胞高表达NKp30、NKp44、NKp46及NKG2D等活化性受体[84-86]，这可能有助于提高HCV感染过程中NK细胞的毒效应功能。另外患者肝脏NK细胞高表达TRAIL可诱导HCV感染的肝细胞凋亡，从而控制HCV的感染[86,87]。NK细胞上TRAIL的表达受到多种因素的调控，来自慢性HCV感染患者病变肝脏组织中的IL-26上调NK细胞上TRAIL的表达[88]；而单核细胞来源的IL-18结合蛋白a(IL18BPa)与IL-36受体拮抗剂(IL36RA)可以抑制NK细胞表达TRAIL[89]。来自肝脏微环境中的其他因素对NK细胞的功能调控同样重要，HCV感染的肝细胞或单核来源的细胞可以通过OX40L-OX40轴与NK细胞直接接触诱导其活化[90]。近来关于microRNA的研究发现，HCV感染者中microRNA-155的重组导致NK细胞下调表达T-bet/Tim-3并产生IFN-γ，促进HCV的清除[91]。以上结果表明，在慢性HCV感染过程中，NK细胞呈现出较强的细胞毒作用对HCV的控制起到一定促进作用，同时也存在造成肝脏损伤的风险。NK细胞在慢性疾病中受到多种环境因素的调控可能有利于其在控制疾病进程与造成肝脏损伤之间找到平衡点。

此外，目前关于HCV的研究当中，NK细胞的功能分析主要通过外周血NK细胞来完成，由于人类肝组织标本难以获取，针对HCV慢性感染小鼠模型中NK细胞的研究显得尤为重要。在模拟HCV感染的挪威大鼠肝炎病毒感染模型中，肝脏NK细胞的数量及IFN-γ的产生在病毒感染后都显著增加，且扩增的细胞主要是cNK细胞，而LrNK细胞的数量保持稳定。在NK细胞清除3 d后，病毒血症明显加重，但病毒清除能力和肝损伤的程度并没有发生显著改变[92]。因此，该模型中NK细胞在感染早期起到了一定抗病毒作用，但后期病毒的清除可能并不主要依赖于NK细胞。构建表达人的occludin蛋白及CD81的近交系ICR小鼠HCV持续性感染模型发现，肝脏CD49b+cNK细胞高表达抑制性受体NKG2A，促进CD8+T细胞应答的能力受到抑制，使得机体不能有效清除HCV[93]。NK细胞在两种模型中相反的作用可能与建模过程和疾病研究的时间点有关。随着对NK细胞的认识逐渐深入，研究不同肝脏NK细胞亚群在HCV感染中所扮演的角色将成为趋势[94]。

3.2肝纤维化 肝纤维化是以胶原蛋白为代表的细胞外基质蛋白过度积累所致，而胶原蛋白主要来自活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)、门静脉成纤维细胞和骨髓来源的肌成纤维细胞，可由各种慢性肝脏疾病引发[95]。NK细胞在肝脏纤维化过程中扮演了双重角色，一方面NK细胞可以通过NKG2D、NKp30或TRAIL依赖的途径杀死应激的肝细胞，加重肝损伤[96]；另一方面，NK细胞可通过产生IFN-γ直接诱导HSC凋亡，也可通过TRAIL杀伤活化的HSC，从而抑制纤维化进展[97,98]。

肝纤维化是HBV/HCV相关性肝损伤的终末期表现，CHB患者的外周血与肝脏中出现高比例的KLRG1+NK细胞，其表面高表达的TRAIL可以结合HSC表面的DR5，从而诱导HSC的凋亡。同时，HSC所产生的骨桥蛋白与KLRG1+NK细胞表面CD44相互结合，从而促进KLRG1+NK细胞产生IFN-γ，延缓肝纤维化的发展[99]。此外，慢性HCV感染所诱导的肝脏炎症环境可能会导致肝脏较低的氧气水平[100]，而组织中的低氧环境已被证明可以调节NK细胞的功能[101]。但研究发现，在体外低氧环境下，NK细胞活化性受体NKp46、NKG2D表达下调，分泌IFN-γ和抗病毒能力下降，而杀伤活化的HSC的能力几乎不受影响，提示低氧环境对NK细胞分泌细胞因子和杀伤HSC的能力影响程度不同[102]。上述研究说明，在慢性HBV/HCV感染向肝纤维化进展的过程中，NK细胞对于HSC的杀伤作用可有效延缓疾病的进程，其内在机理和调控因素值得进一步探究。

3.3肿瘤 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌，其发生发展与HBV、HCV的慢性感染以及脂肪肝的疾病进展有关[103]。近十年来，肺癌、结肠癌和前列腺癌等癌症的发病率都有所下降，而肝癌的发病率逐年上升，已成为全球癌症相关死亡的主要原因之一[104]。与其他器官相比，NK细胞在健康肝脏中富集，肝脏NK细胞杀伤活性的增强对肝脏肿瘤的免疫监测不可或缺。其中NK细胞活化性受体NKG2D对NK细胞识别和清除肿瘤具有非常重要的作用[105]，但肝癌组织NKG2D配体表达下调，从而逃避NK细胞的免疫监视，靶向转录抑制因子EZH2可上调NKG2D配体的表达，从而增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用[106]。除了细胞间直接接触，活化的NK细胞产生IFN-γ对于抗肿瘤免疫同样具有积极作用[107]。然而，在HBV转基因小鼠模型中，肝脏NK细胞来源的IFN-γ通过EpCAM-EMT轴却促进了HCC的发生[108]，这提示NK细胞产生的IFN-γ可能在慢性炎症向HCC转化中起促进作用，而在后期发挥抗肿瘤作用。

在HCC患者中，多种细胞作用于NK细胞影响其抗肿瘤功能。肝癌患者髓系来源的抑制细胞(MDSCs)以接触依赖的方式直接抑制NK细胞的细胞毒作用和细胞因子的产生[109]。此外，肿瘤微环境中CD4+CD25+调节性T细胞增多，可能抑制肿瘤浸润的NK细胞产生IFN-γ并减弱其杀伤能力[107]。而经过多靶点激酶抑制剂索拉非尼处理的巨噬细胞与NK细胞共培养可以诱导NK细胞的活化与扩增[110]。HCC的发生过程往往伴随抑制性细胞的产生，这些细胞通过直接接触或者分泌细胞因子的方式负调免疫系统中的效应细胞，进而加速HCC的进程。针对细胞间复杂调控网络的研究对于了解NK细胞在肿瘤发生发展中功能状态的变化尤为必要。

免疫卡控点阻断疗法是近年来肿瘤治疗领域的重要突破，基于逆转NK细胞功能耗竭的免疫卡控点疗法可能为HCC的治疗提供新思路。HCC患者肝组织中，NKG2A高表达的CD56dimNK细胞与瘤内肝癌组织表达的NKG2A配体HLA-E相互作用，使NK细胞功能耗竭，并与不良愈后相关[111]。对HCC患者样本进行相关性分析发现，编码CD96和LAG-3等抑制性卡控点受体的基因在CD49a+NK细胞上的表达水平显著高于CD49a-NK细胞，研究表明，CD96和LAG-3在免疫细胞上的高表达使其呈现一种功能耗竭表型从而造成了肿瘤的免疫逃逸[112,113]，CD49a+NK细胞在肝脏肿瘤中的积累可能会导致疾病状况恶化和愈后较差[114]。此外，小鼠LrNK细胞高表达的抑制性受体PD-L1与肝脏T细胞表面的PD-1结合进而抑制适应性免疫应答，通过阻断PD-1-PD-L1轴可有效恢复T细胞功能[74]。这些发现为HCC临床治疗提供了新的靶标。同时，免疫卡控点阻断通过增加免疫系统的活性可能会产生炎症副作用[115]，所以，进行免疫卡控点阻断治疗的患者需要进行多方面的风险评估以降低临床治疗可能带来的负面影响。

图2 人类肝脏NK细胞与肝脏疾病的关系

Fig.2 Relationship between human liver NK cells and liver disease

Note: Human liver NK cells play an important role in the development of HBV/HCV infection,liver fibrosis and hepatocellular carcinoma (HCC).During acute hepatovirus infection,activated NK cells kill virus-infected target cells and release effector cytokines to control virus infection,but over-activation of NK cells may cause liver damage.However,in chronic infectious disease and HCC,NK cells gradually become exhausted with disease progression.

4 总结与展望

肝脏作为最大的实体器官，具有独特的免疫学特性，肝脏含有包括NK细胞在内的大量淋巴细胞[116]，稳态下肝脏NK细胞与外周NK细胞显著不同，其表现出独特的表型和功能特征且具有肝脏特异性[41,117]。以往研究表明肝脏NK细胞在病毒性肝炎、肝纤维化和肝癌等疾病的发生发展中发挥重要作用(图2)。对于肝脏疾病患者的肝脏NK细胞进行表型与功能的全面研究为肝脏疾病治疗提供了新思路。目前，关于人类与小鼠肝脏NK细胞亚群的研究又将NK细胞进一步划分为cNK细胞和LrNK细胞[40,44]，探索不同肝脏NK细胞亚群在肝脏疾病中的分工可能成为未来的研究热点。此外，在慢性噬肝病毒感染和肝癌发生发展的过程中，NK细胞往往处于免疫抑制的状态，针对NK细胞上的抑制性受体开发相关阻断抗体或拮抗剂，可以逆转NK细胞的耗竭状态并恢复NK细胞的功能，从而控制疾病的发展；然而NK细胞的过度活化可能诱使肝细胞死亡，加重肝脏损伤，因此，在评估免疫卡控点阻断疗法时，需要综合考虑NK细胞潜在的价值和风险。