益生菌摄入对铅暴露大鼠社会行为的影响

黄曦瑶, 汪惠丽

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

随着经济的飞速发展,环境问题日益突出,危害着人类的身心健康。同时,随着生活水平的提高,人们开始追求生活质量的更高标准,致力于在日常的生活饮食中巩固和改善自己的身体状况。人体肠道内生活着数百种、数十万亿种不同的微生物需要依靠人体才能存活,但同时也与寄主的健康状况息息相关。而益生菌作为一种有益菌对肠道菌群的稳态以及身体起到了积极的作用,因此也渐渐意识到益生菌带给人们的有益作用。

工业生产、金属冶炼、化肥杀虫剂的使用等使得铅(Pb)、镉(Cd)、砷(As)和汞(Hg)等重金属广泛地分布于环境中[1-4]。环境中的重金属严重影响土壤的寿命以及水生和陆生生物的生命,同时环境中的重金属可以在土壤中富集，继而被植物吸收蓄积于体内最终通过食物链进入人体,从而损害机体健康[5-8]。其中铅是一种多系统、多亲和性的环境毒物,性质稳定且无安全剂量,可以影响包括神经、造血和内分泌等系统[9]。近年来,国内外对铅的神经毒性的研究取得了一系列进展,如干扰神经递质的传递与神经递质受体表达,引起氧化应激,加剧海马、纹状体等区域细胞的死亡。除此以外,有文献表明社会行为也是毒理学的效应表征之一,且早期重金属锰的暴露可导致小鼠的顺从行为[10-12]。铅暴露的毒性机制如今已在细胞、基因表达、分子水平等多个方面展开积极性的探索,但铅与大鼠社会行为的研究目前较少,考虑到铅的毒性作用，本文探究早期铅暴露对大鼠社会行为的影响。

社会生活使动物易于获得食物,增加自我繁殖,降低掠食风险,但也会导致个体过度与关键资源竞争[13-14]。同时激烈的攻击行为也会让个体花费更多的时间和精力,更有可能吸引掠食者,因此为避免此类风险,许多动物进化出明显的等级制度以降低同种个体的攻击行为，进而形成稳定的优势——从属关系[14]。动物社会等级因个体在种群内的状态及竞争者而存在较大的差异,社群经历、生活环境等因素均可制约动物的社会等级[15]。对于生命有机体来说,环境对动物的发育具有一定的影响,尤其是早期生活环境受损可能会使动物的大脑发育造成异常,进而影响个体后续的发展。

肠道微生物与人体共生且互相适应,肠道微生物的变化或失调影响机体功能,与一些疾病的发生发展有关,如肠道疾病、代谢性疾病、免疫性疾病、心血管疾病等,还能影响大脑发育和功能,如孤独症、阿尔茨海默病、帕金森综合征等[16-17]。异常稳态的机体可以通过重建体内菌群的生态平衡来实现缓解和治疗。有研究发现益生菌可以通过大脑以及中枢神经对动物的行为产生一定的影响,但具体的机制尚不明确。因此本文旨在建立社会优势行为的表征模型,研究早期铅暴露对大鼠社会行为的影响,并探究肠道益生菌摄入是否能够修复早期铅暴露引起的机体损伤。

1 材料方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

实验所用的SD大鼠从安徽医科大学动物实验中心获得,喂养在恒温25 ℃,光照12 h,黑暗12 h的SPF级动物房内。将发育期的母鼠设置为铅组、铅+益生菌组、益生菌组和空白对照组。所有的大鼠都能获得同等标准的食物和水,子代大鼠在发育期通过母鼠获取铅(50 mg/L),断奶之后通过饮水摄入铅。益生菌通过单独的容器给予(每只1010cfu/d),并保证大鼠在5 min内取食完,待大鼠长至成熟期(PND 90)时开始进行动物行为学实验(每组10只雄鼠)。各组大鼠的平均体质量为413.09 g(空白对照组);414.75 g(铅组);422.40 g(铅+益生菌组);413.57 g(益生菌组)。

1.1.2 实验器材及所用菌

透明笼子(50 cm×50 cm×50 cm),XR-XZ301自发活动旷场分析系统(上海欣软信息技术有限公司)。益生菌(生合生物科技有限公司),其中包括嗜酸乳杆菌(LA1063)、鼠李糖乳杆菌(LRH10)、副干酪乳杆菌(LPC12)、嗜热链球菌(ST30)、瑞士乳杆菌(LH43)、发酵乳杆菌(LF26)、长双歧杆菌(BL986)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠编号

在大鼠幼年时使用不同的标记物在其尾巴上做标记,每组大鼠的编号为1～10。在大鼠90 d时进行称重记录,后续实验进行配对,要求配对的2只大鼠体质量之间的差异在10 g之内。

1.2.2 公平条件下的社会竞争实验

侵略行为是几乎所有动物的自然行为之一,从生物学的角度来看,攻击性行为可以被视为旨在主动控制社会环境的一种社交沟通方式。但是在与对手互动中进行的一系列典型性攻击行为,如打击侵略、身体冲突等不仅对受害者不利,而且对侵略者也有害。因此,动物群体中也渐渐进化出一种机制来最小化和控制身体攻击,以防止其潜在的不利后果,如威胁行为。同样的大鼠社会中,不同大鼠也常常为了争夺领地、配偶等资源进行一定的威胁行为和攻击行为,用来宣誓主权。因此为了探究大鼠社会竞争行为展开以下实验。

笼子在使用前用酒精清洗消毒,然后将2只不同组别的大鼠放在笼子里,计时10 min,然后观察10 min内每只大鼠攻击性行为发生的时间和次数(特征行为小于1 s的组别排除)。同时为了实验的严谨性,大鼠的社会探索行为也需要被一并考量,作为对照。实验中记录大鼠的攻击性行为包括站立、按压、侧面威胁、扭打、追逐;普通社会探索行为包括探索、闻气味和梳毛等。

1.2.3 水剥夺实验

为了更好地反映各组大鼠的社会行为差异,将大鼠生活环境中的一个资源剥夺一段时间后,通常大鼠为了抢夺资源,会表现出更加强烈的攻击行为和抢夺行为,以此来观察和判断其社会竞争力。取走大鼠笼子里的水源,至少断水24 h,然后将2只不同组的大鼠放到有水源的透明立方体笼子里,该水源1次只能让1只大鼠饮用。观察并记录每只大鼠在10 min内喝水的次数和喝水的时间,其中每次抢水成功和抢水失败的情况也要记录。该实验重复3次,且每次实验配对的老鼠都是相同的,目的是让大鼠形成稳定的社会秩序,以此来观察每只大鼠的社会资源竞争力。

1.2.4 旷场实验

旷场实验主要是观察实验动物在全新环境中的自主探索行为、与神经系统相关的焦虑度等,以及实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等,反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为。当大鼠进入到一个全新的、空旷的环境中,由于未知和紧张,一般会在环境的边缘进行探索,然后逐渐向中心靠拢。如果大鼠长期在边缘探索不向中间靠拢,那么表示该大鼠具有较高的焦虑度和紧张感。

大鼠旷场反应箱高35 cm,底边长100 cm,内壁全黑,底面平均分为16个小方格,正上方1.5 m处安装一数码摄像头,使其视野可覆盖整个旷场内部。在安静的环境下,将大鼠逐个放在开口的黑色木盒里,同时进行摄像和计时。每只大鼠接受1次测试,将小鼠面朝墙放入4个拐角方格之一,并让其自由探索环境5 min。每次实验后清洗方箱内壁及底面,以免上次实验动物余留的信息(如动物的大小便、气息)影响下次实验结论,之后更换动物继续实验。记录和观察大鼠在边缘和中间区域的时间、速度、行走路程等,同时还包括潜伏期、周边时间、直立次数(2只前爪离地)。

1.3 数据分析

本实验采用SPSS软件进行分析,结果采用“均值±标准差”来表示。分析组间差异时采用T-test和One-way ANOVA方法进行,ns 表示无显著性差异；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。

2 结 果

2.1 公平条件下的社会竞争实验

2.1.1 铅暴露导致大鼠表现出从属性行为特征

实验结果通过计算不同行为类别的分数来获得,即总进攻得分:侧面威胁、直立、扭打、压制和追逐的总和;总探索评分:社交探索、生殖器嗅探和社交行为的总和。统计每只大鼠在笼子里的社会优势特征行为次数,并计算10 min内每只大鼠不同行为与总观察时间的百分比,分析其显著性。记录的行为参数应覆盖观察时间的100%,这有利于更加公正地解释结果。

将每次实验的同组大鼠的特征行为相加进行整体分析,可以观察到不同组的普遍情况而并非个体。所有数据整理后的结果如图1所示。

图1 慢性铅暴露导致大鼠表现出从属性行为特征

从图1可以看出,空白对照组的社会优势行为所占比例显著高于铅暴露组，表明生命早期持续的铅暴露严重损伤了大鼠在社会等级中的竞争能力,而整体上表现出从属性的行为特征。

2.1.2 益生菌摄入修复铅鼠的从属性行为特征

本文研究益生菌是否能够修复铅鼠的从属性行为特征如图2所示。

图2 益生菌摄入改善铅暴露大鼠的从属性行为特征

从图2可以看出,肠道益生菌的摄入能够明显修复铅鼠在社会等级竞争中的弱势地位,并且能够修复到与空白对照组差不多的水平。表明益生菌摄入可以修复慢性铅暴露大鼠的从属性行为。

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2.2 水剥夺实验

2.2.1 铅削弱大鼠在资源剥夺实验中的地位

为了进一步验证铅暴露确实能够导致大鼠在社会优势行为中的竞争能力,本文对大鼠进行水剥夺实验。2只大鼠在缺水的情况下会互相争抢水源,占有水资源更久的一方则表现更加强势。统计每组大鼠的喝水时间相加占总喝水时间的百分比,结果如图3所示。

图3 铅暴露大鼠在资源剥夺实验中的表现

从图3可以看出,第1次实验时2组大鼠的喝水时间占比并无显著性差异,而在第2、3次实验时,由于各组老鼠在实验之前是分笼饲养的,彼此之间还未存在等级关系,而在经过实验形成社会秩序和等级,使得空白对照组的喝水时间占比逐渐增多。实验结果表明，早期铅暴露能够影响大鼠在资源剥夺实验中的竞争能力。

2.2.2 益生菌摄入改善铅鼠在资源剥夺中地位

之前的实验表明早期铅暴露削弱大鼠在资源剥夺实验中的竞争能力,接下来本文探究益生菌的肠道摄入是否能够改善这种现象,结果如图4所示。

由图4可以看出,第1次和第2次实验时2组大鼠的喝水时间占比并无显著性差异,但是在第2天的实验中铅+益生菌组具有优于铅组的趋势,同时在第3天时社会等级已经形成,因此在喝水时间上体现出显著的差异。

图4 益生菌摄入对改善铅暴露大鼠的竞争能力影响

2.3 旷场实验

研究表明某些社会行为与焦虑情绪表现出明显关系,本文拟进一步对上述实验条件下SD大鼠的焦虑行为进行检测,以确定早期铅暴露影响的是大鼠的社会优势行为而非焦虑情绪。统计每组小鼠进入旷场中心区域的数据如图5所示。

图5 铅暴露与益生菌摄入对大鼠焦虑情绪的影响

由图5a可知,进入中心区域探索的时间,即从大鼠身体2/3进入中心区域开始计算大鼠在中心区域活动的总时间;由图5b可知,潜伏时间即大鼠从进入旷场到第1次进入中心区域时经历的时间;由图5c可知,进入中心区域的次数即大鼠在5 min内总共进入中心区域的次数。

从图5可以看出,铅暴露以及益生菌的摄入对大鼠的焦虑情绪无显著影响,表明早期铅暴露与益生菌摄入对大鼠社会行为的影响与其焦虑无关。

3 讨 论

生活环境的破坏对动物的生长发育都有着十分不利的影响,尤其是早期生活环境受损可能会使动物的大脑发育造成异常。已有实验发现早期重金属暴露增加成年动物自闭症行为,早期饮用水铅等重金属的暴露可导致后代行为的缺陷,多次行为异常,且这种情况会持续到成年。有研究表明发育期铅暴露能导致多动症的发生,损伤大鼠神经系统[18-19]。

肠道微生物与机体健康息息相关,能够促进肠道的消化吸收、代谢和免疫等[20-21],同时也与某些疾病的发生有关。在本文研究中,早期铅暴露会对大鼠社会优势行为造成影响,肠道微生物的改变可能是其影响机制。这种影响具体表现为:早期铅暴露影响大鼠的社会优势行为,表现为在群体里的活跃度不高、较为胆小,与其他大鼠斗争时也表现出较为弱势的一面。而益生菌的摄入可以恢复铅暴露对大鼠社会优势行为的影响。这种恢复过程可能是大鼠通过长期食用益生菌使得肠道微生物调整,这种调整通过神经系统影响大脑,促进了大鼠特定脑区神经元的改变和生长,从而使得大鼠的社会行为恢复。

综上,益生菌给宿主带来的好处不仅是肠胃的健康,还会给其大脑、神经系统带来很大的帮助。但是益生菌影响神经系统的具体机制依然有待探究,如益生菌摄入后定殖于肠道的具体位置;其改善机体健康的分子机制,影响大脑的分子路径;起作用的是菌体本身还是其代谢产物等问题都亟待解决。