胶滴肿瘤药敏检测技术评价卡培他滨对胃癌体外药敏实验的条件探索

智慧芳，李春凤，贾玉霞，赵九娥，倪君君

北京和合医学诊断技术股份有限公司中心实验室，北京100011

近年来早期诊断和外科手术技术的发展，为癌症患者带来了希望。然而，胃癌作为中国发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一，复发率和转移率也较高，所以术后辅助化疗仍然是胃癌综合治疗的重要组成部分[1-2]。由于肿瘤的异质性，即使同一化疗方案，不同患者产生的疗效也差异显著，因此，选择适合个体的化疗药物，既可提高疗效避免不必要的不良反应，同时也可减轻患者的经济负担[3]。胶滴肿瘤药敏检测技术（collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）是利用胶原凝胶在37℃时形成三维立体结构的特点，将肿瘤细胞包埋于胶滴中，模拟体内实体肿瘤细胞生长的微环境，从而在相似的生长环境中评价化疗药物的有效率。CD-DST具有原代细胞培养成功率高、所需细胞量少、检测药物种类多等优点，使肿瘤个体化治疗成为可能[4-5]。该技术在肿瘤体外药敏检测中的应用研究已有十余年的历史。卡培他滨（capecitabine，CAP）作为5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的前体药物，也是胃癌辅助化疗的常用药，由于其不良反应小，疗效显著，已被广泛应用于临床。相较于其他抗肿瘤药物，CAP具有更好的安全性和有效性[6]。但截至目前未有研究报道在胃癌辅助化疗中CAP的CD-DST培养条件，故本研究对CAP的CD-DST检测条件进行探索，对胃癌患者术后采用CD-DST法进行CAP体外药敏实验进而指导临床CAP用药具有重要意义。口服给药后，CAP首先被肝脏中羧酸酯酶代谢为5'-脱氧-5-氟胞苷（5'-deoxy-5-fluorocytidine，5'-DFCR），然后通过肝脏和肿瘤组织中的胞苷脱氨酶将其转化为5'-脱氧-5-氟尿苷（5'-deoxy-5-fluorouridine，5'-DFUR），最后在肝脏和肿瘤组织中胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）的作用下，将5'-DFUR进一步代谢为5-FU发挥抗肿瘤作用[7]。研究证实，TP是一种与肿瘤相关的血管生成因子，在肿瘤细胞中的表达高于正常细胞，这可能是一些研究者报道的恶性肿瘤优先将5'-DFUR转化为5-FU的重要原因之一。TP的活性决定了CAP的抗肿瘤效力[8-9]。由于CAP代谢过程复杂不仅需要多种酶同时参与，并且需要肝脏起始代谢，体外代谢比较受限，无法实现CAP的体外CD-DST检测及评价，而5'-DFUR仅需在肿瘤细胞中经TP关键酶的一步代谢就可转化为发挥抗肿瘤作用的5-FU，故本研究选择CAP的代谢产物5'-DFUR进行CAP的CD-DST检测条件探索。本研究选取65例新鲜胃癌组织标本，体外通过对不同药物浓度的5'-DFUR进行CD-DST检测及评价，并分析5'-DFUR在胃癌术后辅助化疗中的敏感性与临床有效率的一致性，进而确定CD-DST法评价CAP进行药敏检测的实验条件。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年5月至2017年9月北京多家综合性三级甲等医院的65例胃癌患者的新鲜肿瘤组织标本。患者纳入标准：①术前经胃镜活检病理诊断为胃癌；②无严重全身系统性疾病；③无远处转移。排除标准：①术前采用化疗或放疗；②合并其他肿瘤；③有其他脏器切除。65例患者年龄38～87岁，性别、分型均随机选取。将65例新鲜胃癌组织标本根据入组时间顺序分为实验组31例和验证组34例。

1.2 主要试剂与仪器

DME/F-12 1∶1培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol diethyl ether diamine tetraacetic acid，EGTA）、伊立替康（irinotecan，CPT-11）购自美国Sigma公司；5'-DFUR购自日本TCI公司；奥沙利铂（oxaliplatin，L-OHP）购自比利时CENEXI-Laboratoires THISSEN S.A.公司；胶滴药敏检测试剂盒Primaster®购自日本Kurabo公司。倒置显微镜购自日本Olympus公司；Primage图像分析系统购自日本Kurabo公司。

1.3 CD-DST法[10-11]

1.3.1 原代肿瘤细胞分离与培养首先用生理盐水洗涤肿瘤组织标本5次，然后用眼科剪将肿瘤组织标本剪成小块，同时尽量去除如脂肪、黏膜、结缔组织、坏死组织等非肿瘤细胞组织，再用刀片将组织切碎成泥状，EZ酶消化1～2 h，1300 r/min离心3 min，收集消化后的肿瘤细胞团块，将其接种于CG培养瓶中，用PCM-1培养基在37℃、5%CO2培养箱中预培养24 h，获得原代胃癌细胞。

1.3.2 胶原凝胶滴培养培养24 h后，收集预培养的贴壁细胞，与试剂盒中胶原混合液（A∶B∶C=8∶1∶1）混合均匀，按照每胶滴30 μl，每孔3个胶滴，将细胞悬液接种于6孔板中，2 h后待胶滴凝固加入3 ml含10%胎牛血清的DME/F-12 1∶1培养基，于37℃、5%CO2培养箱中过夜培养。

1.3.3 抗肿瘤药物接触与清洗培养24 h后加入抗肿瘤药物，药物测试条件根据药物服用特点、以往的研究结果及参考文献[2,12-15（]表1），分别设未用药物的阴性对照孔（Control）以及L-OHP和CPT-11（临床胃癌常用药）处理的阳性对照孔，同时将0-time组（加药起点的未处理组）进行染色固定。培养相应时间后，用DME/F-12 1∶1培养基清洗2次，每次15 min，然后用无血清培养基PCM-2继续培养5天，其中第3天更换一次培养基。

表1 抗肿瘤药物接触条件表

1.3.4 染色固定与扫描第9天进行染色固定，使用终浓度为50 μg/ml的中性红染色2 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞 3次，每次5 min，中性福尔马林固定45 min，蒸馏水清洗15 min，通风干燥，分析具有活性的肿瘤细胞。（图 1）

图1 染色固定干燥后的胃癌细胞（中性红染色，×40）

1.4 数据分析

采用Primage图像分析系统对胶滴进行分析。Control组吸光度（optical density，OD）值与0-time组OD值的比值表示生长率，若生长率小于0.8，则判定为检测没有意义[16]。

药物敏感度通过加药组OD值/Control组OD值（T/C）表示，若T/C＜50%，说明个体肿瘤细胞对相应药物敏感度较高（高敏感）；T/C为50%～60%，说明个体肿瘤细胞对相应药物敏感度处于高敏感与低敏感的临界范围（临界）；T/C＞60%，说明个体肿瘤细胞对相应药物敏感度较低（耐药）。

2 结果

2.1 Primage图像分析结果

采用Primage图像分析系统对胶滴图像数据进行读取，原代肿瘤细胞团在胶滴内呈三维立体式增殖生长，与肿瘤细胞在人体内的生长环境相似。与加药组相比，Control组肿瘤细胞活性好，增殖较快；加药组呈现出不同程度的细胞凋亡，主要表现为细胞团变小且数量减少。（图2）

图2 编号20170523-709标本的Primage图像分析结果（×40）

2.2 实验组抗肿瘤药物的CD-DST检测结果

31例新鲜胃癌组织标本中，26例可评价，检测成功率为84%（26/31），5例检测失败原因为肿瘤细胞含量低，生长率低于0.8。检测成功的26例中，随着5'-DFUR浓度（3、5、10 μg/ml）的增加，体外有效率（in vitro sensitivity，IVS）也呈增长趋势，高敏感IVS分别为23%、31%和46%（表2），由于已报道CAP单药的胃癌临床有效率约为30%[17-18]，因此，本研究结果表明，胃癌体外药敏实验中，5 μg/ml的5'-DFUR为CAP体外药敏检测CD-DST法的最适实验条件。

表2 实验组抗肿瘤药物的CD-DST检测结果（n=26）

2.3 验证组 5'-DFUR的CD-DST检测结果

由于实验过程中的胃癌标本有限，为了进一步验证胃癌中5'-DFUR的IVS与CAP临床有效率的一致性，采用5 μg/ml的5'-DFUR对另外34例胃癌标本进行了CD-DST法评价，其中1例检测失败，是由于肿瘤细胞量较少不足以检测；33例可评价，检测成功率为97%（33/34）。其中，高敏感IVS为30%（10/33），与实验组结果一致，即 5 μg/ml的5'-DFUR的IVS与CAP临床有效率一致。

3 讨论

尽管临床诊断和治疗技术在不断提高，但胃癌由于其高度异质性、术后易复发和转移的特点，仍然是全球第三大癌症死亡原因[19]。术后辅助化疗是胃癌治疗中的重要组成部分，目前一般采用经验性用药，但是由于肿瘤的异质性和患者的个体差异，导致疗效差异显著。随着肿瘤个体化治疗思想的提出，研究者建立了ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）、MTT等体外药敏检测技术，但都存在一定的局限性。相较于上述方法，Kobayashi[11]提出的CD-DST法具有原代细胞培养成功率高、需要的肿瘤细胞量少、临床相关性高、操作简单、培养时间短以及避免成纤维细胞干扰等优点。研究表明，CD-DST法对胃癌原代细胞在化疗药物敏感性检测中取得了较理想的结果[20]。

CAP、5'-DFUR以及5-FU是临床上胃癌、结直肠癌辅助化疗的常用药，CAP与5'-DFUR以及5-FU相比，具有更好的安全性和有效性[6]。但作为口服抗癌前体分子的CAP在肿瘤组织细胞内选择性地被TP代谢为5-FU，其疗效已经在多个临床试验中确定，而且毒性小于5-FU，口服比持续静脉注射更易被患者接受，因此，CAP可能是替代静脉注射5-FU的理想选择[21]。在进展期胃癌的化疗中，CAP具有较高的抗癌活性，由于CAP的体外代谢受限，而5'-DFUR作为CAP重要的代谢产物，只需在肿瘤组织细胞中TP的作用下一步代谢即可转化为发挥抗肿瘤作用的5-FU。为了胃癌患者术后采用CD-DST法进行CAP体外药敏实验，本研究选择CAP的代谢产物5'-DFUR进行CAP的CD-DST药敏检测实验条件探索。研究结果显示，CD-DST法评价胃癌原代细胞对CAP的药敏条件检测结果稳定，胃癌原代细胞对不同浓度5'-DFUR的敏感度差异明显，5 μg/ml的5'-DFUR在体外药敏实验条件检测中对胃癌的高敏感率为30%左右，这与文献报道的临床CAP单药一线治疗晚期胃癌的有效率一致[22-23]。同时本研究结果显示抗肿瘤药物L-OHP和CPT-11的单药敏感率检测结果与实际临床单药治疗有效率相符[24-25]。综上结果表明，采用CDDST法评价分析CAP在胃癌术后辅助化疗中的药敏检测条件对胃癌患者术后进行体外药敏实验及临床化疗药物的选择指导具有重要意义。

另有研究表明，CAP与第三代铂类抗肿瘤药物L-OHP联合用药对晚期胃癌疗效显著，且不良反应小[26]，而CD-DST技术作为临床指导用药的重要参考，本实验室利用CD-DST法对CAP与L-OHP联合用药对肠癌原代细胞进行了体外药敏检测实验条件探索，初步结果显示，在肠癌中有效率约为55%，与文献报道的年龄较小患者临床有效率为58%和年龄较大患者临床有效率为52%一致性较高[27]。而CAP与L-OHP联合用药对胃癌的IVS及其药敏检测实验条件正在进一步研究中。针对联合用药方案的CD-DST药敏检测实验条件及药敏实验是今后研究的方向，旨在为肿瘤患者术后进行体外药敏实验及临床化疗药物的选择指导提供重要参考。