打叶复烤环节碳酸钠缓冲液处理对贮藏片烟TSNAs 累积和烟叶品质的影响

刘兴余，刘德水，马莉，马雁军， 杨振东，张杰，林琳，白若石*，周骏

1 上海烟草集团北京卷烟厂有限公司技术中心, 北京市通州区万盛南街99号，北京 101121；2 北京市烟草质量监督检测站，北京市通州区九棵树西路196号，北京 101121

烟草特有N-亚硝胺（TSNAs，Tobacco Specific N-nitrosamines）是烟草特有的N-亚硝基类化合物，主要包括4 种致癌化合物：4 -（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK，4-(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）、N-亚硝基去甲烟碱（NNN，N’-Nitrosonornicotine）、N-亚硝基新烟碱（NAT，N’-Nitrosoanatabine）、N-亚硝基假木贼碱（NAB，N’-Nitrosoanabasine）[1]。TSNAs 是卷烟烟气和烟叶中同时存在的致癌物质[2]。在烟草中TSNAs 的形成普遍认为是由烟草中的生物碱和亚硝盐反应形成的[3-5]，由于晾晒烟中的TSNAs 含量明显高于烤烟，使得绝大多数科学工作者集中在晾晒烟的研究上。

近几十年来，如何降低晾晒烟烟草中的TSNAs的含量一直是烟草科研工作者研究的重点。目前已有多种方法可降低TSNAs的含量，如，在遗传育种阶段，可通过基因手段，培育低生物碱和低亚硝酸盐的品种[6-8]；在种植阶段，可改变栽培方式和施肥比例降低采后烟叶中TSNAs的生成量[9-10]；在烟叶采后调制阶段，控制温湿度和改变烘烤条件可抑制TSNAs的生成[4-5]；在贮藏阶段，控制温湿度可控制TSNAs的升高[11-13]；通过烟草加工过程中的辐照技术，可降低烟草及卷烟中TSNAs[14-15]。上述多种方法均可降低烟叶中TSNAs的含量，但有些方法存在一定的负面效应，如，影响烟叶品质和感官质量等，真正实现产业化的降TSNAs措施并不太多[16]。

已有研究证实烟叶贮藏过程是TSNAs 累积的重要阶段[11,17-18]，贮藏过程中烟叶pH 值呈弱酸状态（pH=5～6），适当提高烟叶pH 值是否影响贮藏期间TSNAs 的累积未见报道。同时，pH 值是影响烟叶品质的重要因素，因此需要考察贮藏过程中提高pH 值对烟叶品质的影响。基于烟叶自身缓冲能力、缓冲液毒性及尽量减少烟草外源性化合物的添加以及考虑到燃烧性和吸食口感，本研究选择碳酸钠缓冲液作为调整烟叶pH 值的制剂，将打叶复烤过程作为施加环节，研究了碳酸钠缓冲液对马里兰和白肋片烟贮藏过程中TSNAs 累积和烟叶品质的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

马里兰烟（C2，2016 年9 月采收）、白肋烟（C2F，2016 年9 月采收）、碳酸钠（纯度99.0%，天津渤化永利化工股份有限公司，天津，中国）、碳酸氢钠（纯度99.0%，天津渤化永利化工股份有限公司，天津，中国）。

ICS-3000 型离子色谱仪（ThermoFisher Scientific公司，马萨诸塞州，美国）、在线固相萃取-高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（Spark Holland 公司，埃门，荷兰）、AA3 型连续流动分析仪（SEAL Analytical GmbH，德国）、pH 计（梅特勒-托利多公司，俄亥俄州，美国）、LR5091 型温湿度记录仪（HIOKI E.E.公司，长野，日本）。

1.2 方法

1.2.1 打叶复烤过程中添加碳酸钠缓冲液

根据前期研究，选择碳酸钠缓冲液作为打叶复烤过程中调整烟叶pH 值的制剂。在复烤前的翻料装置中，通过高压喷雾将碳酸钠缓冲液（Na2CO3∶NaHCO3=9 ∶1）按照烟叶干基重量的25%（体积/重量）均匀喷洒在片烟表面，实验设置碳酸钠缓冲液0.75 mol/L 低浓度处理组和1.5 mol/L高浓度处理组。施加完碳酸钠缓冲液的片烟进入喂料柜，复烤至正常水分（12%），并装箱（180 kg/箱）。烟箱平放且不码垛，贮藏于北方某仓库，进行自然醇化，定期取样。由于贮藏环境温湿度会影响TSNAs的生成，故采用年/月/日表示贮藏时间。

1.2.2 烟叶贮藏期间温湿度的采集

将温湿度记录仪放置于离烟箱上部1 m 位置，记录烟叶贮藏期间的环境温湿度变化。

1.2.3 烟叶中TSNAs 的测定

采用Zhang 等方法检测贮藏期间片烟中TSNAs含量[19]。

1.2.4 烟叶中碳酸钠-碳酸氢钠的测定

对1.2.1 贮藏过程中采集的烟叶样品，参考瑞士万通仪器公司IC Application Note No. O-30 方法[20]，采用离子色谱法检测烟叶中碳酸根和碳酸氢根的含量。

1.2.5 烟叶pH 值得测定

针对贮藏期间采集的样品，按照YC/T 222—2007方法测定烟叶的pH 值。

1.2.6 烟叶的外观质量检测

贮藏期的片烟外观检测，参考GB/T 8966—2005，从颜色、叶片结构、叶面、光泽、颜色强度角度，对片烟的外观质量进行检测。

1.2.7 烟叶含水率检测

针对贮藏期间采集的样品，按照YC/T 31—1996方法测定烟叶贮藏期间的含水率。

1.2.8 烟叶常规化学成分的测定

18个月贮藏期间，对马里兰和白肋片烟进行取样，按照YC/T 468—2013 方法测定烟叶中的总植物碱含量，按照YC/T 162—2002 方法测定烟叶中的氯含量，按照YC/T 217—2007 方法测定烟叶中的钾含量，按照YC/T 161—2002 方法测定烟叶中的总氮含量，按照YC/T 377—2017 方法测定烟叶中氨含量，按照YC/T 35—1996 方法测定烟叶中的总挥发碱含量，按照YC/T 159—2002 方法测定烟叶中的总糖含量。

1.2.9 烟叶感官质量评价

针对贮藏18 个月的烟叶，参考YC/T 138—1998方法，从香型、香气质、香气量、浓度、劲头、杂气、刺激性、余味和工业可用性方面评价烟叶的感官质量。

1.2.10 数据处理与分析

采用SPSS V17.0进行数据处理和作图，采用One-Way ANOVA对测定指标进行单因素方差分析，P＜0.05表明两者差异显著，P＜0.01表明两者差异极显著。

2 结果

2.1 烟叶贮藏期间温湿度变化

对照组和处理组贮藏环境为可通风自然仓储环境，烟叶处于自然醇化状态。温湿度记录了该仓库2017 年4 月15 日至2018 年10 月31 日温湿度数据。结果如图1 所示，烟叶贮藏期间最低温度-8.6℃，最高温度为36.4℃，最低相对湿度为21.8%，最高相对湿度为82.8%。

2.2 碳酸钠缓冲液对贮藏期间烟叶中TSNAs 累积的影响

贮藏期间马里兰烟叶中TSNAs 含量变化趋势如图2 所示，经过18 个月的贮藏，对照组烟叶中总TSNAs 含量增加了310.6%（7579.0 μg →31121.1 μg）；低浓度处理组烟叶中总TSNAs 含量增加了181.5%（8156.3 μg →22962.1 μg）； 高 浓 度 处理组烟叶中总TSNAs 含量增加了140.8%（7698.9 μg →18540.1 μg），且该处理组烟叶中TSNAs 含量比对照组低40.4%。贮藏期间白肋烟叶中TSNAs 含量变化趋势如图3 所示，经过18 个月的贮藏，对照组烟叶中总TSNAs 含量增加了289.3%（6097.7 μg →23740.0 μg）；低浓度处理组烟叶中总TSNAs含 量 增 加 了224.7%（5962.0 μg →19362.0 μg）；高浓度处理组烟叶中总TSNAs 含量增加了149.5%（6075.7 μg →15158.7 μg），且 该 处 理 组 烟 叶 中TSNAs 含量比对照组低36.2%。

图1 贮藏期间环境温湿度变化Fig. 1 The variation of environmental temperature and humidity during storage

图2 贮藏期间马里兰烟叶中TSNAs 的变化（平均值±标准偏差，n=5）Fig. 2 The variation of the TSNAs level of Maryland tobacco leaves during storage (Mean±S.D., n=5)

经One-Way ANOVA分析处理组与对照组的差异，在所有的贮藏时间点，高浓度处理组的两种烟叶中NNN、NAT、NNK、NAB 和总TSNAs 含量均显著低于对照组（P ＜0.01）。对低浓度处理组的两种烟叶而言，所有贮藏时间点的NNN、NAT 和总TSNAs含量均显著低于对照组（P ＜0.01）。在整个贮藏过程中，烟叶中TSNAs 累积量的高低顺序为：高浓度处理组＜低浓度处理组＜对照组，说明碳酸钠缓冲液具有减少烟叶贮藏过程中TSNAs 累积的作用。另外，夏天气温较高时，TSNAs 生成速率较大，冬季气温较低时，TSNAs 生成速率较小。

图3 贮藏期间白肋烟叶中TSNAs 的变化（平均值±标准偏差，n=5）Fig. 3 The variation of the TSNAs level of Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5)

2.3 贮藏期间烟叶中 和含量

表1 贮藏期间马里兰和白肋烟叶中 和的含量Tab. 1 The contents of and of Maryland and Burley tobacco leaves during storage μg/g

表1 贮藏期间马里兰和白肋烟叶中 和的含量Tab. 1 The contents of and of Maryland and Burley tobacco leaves during storage μg/g

2.4 碳酸钠缓冲液对贮藏期间烟叶pH 值的影响

图4 贮藏期间马里兰烟叶pH 值的变化（平均值±标准偏差，n=5）Fig. 4 The variation of the pH value of Maryland tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

考虑烟叶打叶复烤过程中水分限制、施加均匀性，以及避免烟叶卷曲及损耗，中试工艺试验选择复烤前汇集皮运带的翻料装置。贮藏贮藏过程中烟叶pH 值变化情况如图4 和图5 所示。结果显示，18个月的贮藏期间，马里兰烟对照组pH 值由5.30 降至5.19，白肋对照组pH 值由5.50 降至5.26，马里兰烟低剂量处理组pH 值由6.35 降至5.94，白肋低剂量处理组pH 值由6.70 降至5.96，马里兰烟高剂量处理组pH 值由7.08 降至6.34，白肋高剂量处理组pH 值由7.61 降至6.83。由结果可以看出，高剂量处理组能够较好地保持烟叶处于中性状态。另外，由于在贮藏前期烟叶内部化学反应剧烈，导致处理组烟叶的pH 值下降较快，但贮藏至3 个月后（贮藏中后期），pH 值保持稳定。同时，在pH 快速下降期内（贮藏前期），烟叶中TSNAs 生成速率也高于贮藏的中后期。

2.5 碳酸钠缓冲液对烟叶外观的影响

对照组和碳酸钠处理组的烟叶经18个月贮藏后，烟叶外观如图6 和图7 所示，与对照组比较，处理组烟叶的颜色、光泽和颜色强度无明显区别，也没有出现变暗或变黑。

图5 贮藏期间白肋烟叶pH 值的变化（平均值±标准偏差，n=5）Fig. 5 The variation of the pH value of Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

图6 贮藏18 个月后的马里兰片烟Fig. 6 The appearance of Maryland tobacco leaves after storing for 18 months

图7 贮藏18 个月后的白肋片烟Fig. 7 The appearance of Burley tobacco leaves after storing for 18 months

图8 贮藏过程中马里兰烟和白肋烟烟叶中水分含量（平均值±标准偏差，n=5）Fig. 8 The moisture content of Maryland and Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

2.6 贮藏过程中烟叶中水分含量的变化

如图8 所示，马里兰和白肋烟叶在18 个月的贮藏过程中，对照组烟叶水分含量范围为6.35%～19.64%，低浓度处理组烟叶中水分含量范围为7.12%～22.02%，高浓度处理组烟叶中水分含量范围为6.85%～22.80%，处理组烟叶中含量高于对照组，上述烟叶水分含量随着仓库环境湿度的变化而变化，但均处于可接受的范围。

2.7 碳酸钠缓冲液对贮藏期间烟叶常规化学成分的影响

18 个月的贮藏时间，对照组和处理组烟叶中总植物碱、氯、钾、总氮、氨、总挥发碱和总糖的变化如图9 和图10 所示。对照组和处理组烟叶中总植物碱含量均呈缓慢下降趋势，其中，马里兰对照组烟叶中总植物碱含量由2.28%下降至2.01%，马里兰低浓度处理组烟叶中总植物碱含量由2.22%下降至1.79%，马里兰高浓度处理组烟叶中总植物碱含量由2.24%下降至1.73%。

如图9 和图10 所示，对照组和处理组烟叶中氯含量、钾含量和总氮含量在18 个月的贮藏期内保持稳定，而烟叶中氨含量、总挥发碱含量和总糖含量呈明显下降趋势。其中，马里兰对照组烟叶中氨含量、总挥发碱含量和总糖含量分别由0.29%、0.51% 和3.13% 下 降 至0.22%、0.40% 和1.70%，马里兰高浓度处理组氨含量、总挥发碱含量和总糖含量分别由0.21%、0.42% 和3.22% 下降至0.16%、0.34%和1.35%。白肋对照组烟叶中氨含量、总挥发碱含量和总糖含量分别由0.28%、0.87%和0.88% 下降至0.22%、0.73% 和0.43%，白肋高浓度处理组烟叶中氨含量、总挥发碱含量和总糖含量分别由0.21%、0.69% 和0.87% 下降至0.18%、0.62%和0.34%。

2.8 碳酸钠缓冲液对烟叶感官质量的影响

如表2 所示，马里兰和白肋烟叶处理组感官质量总得分略高于对照组，特别是在杂气和刺激性方面，两种烟叶的处理组得分值明显高于对照组，其它感官指标处理组与对照组烟叶差别不大，说明碳酸钠缓冲液处理后的烟叶，经过18 个月的贮藏后，杂气和刺激性明显下降。

图9 贮藏期间马里兰烟叶中总植物碱、氯、钾、总氮、氨、总挥发碱和总糖的含量变化（平均值±标准偏差，n=5）Fig. 9 The variation of total plant alkali, chlorine, potassium, total nitrogen, ammonia, total volatile alkali and total sugar in Maryland tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

图10 贮藏期间白肋烟叶中总植物碱、氯、钾、总氮、氨、总挥发碱和总糖的含量变化（平均值±标准偏差，n=5）Fig. 10 The variation of total plant alkali, chlorine, potassium, total nitrogen, ammonia, total volatile alkali and total sugar in Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

表2 碳酸钠缓冲液处理组和对照组烟叶感官质量评价结果Tab. 2 Sensory quality evaluation results of sodium carbonate buffer treatment group and control group

3 讨论

多年来，如何降低晾晒烟中的TSNAs 的含量一直是烟草科研工作者研究的重点。从TSNAs 的生成机理可以看出[2]，烟碱及其衍生物是导致TSNAs 生成的前体物，烟碱类物质存在于烟草中，TSNAs 便难以完全除掉，这也导致降低甚至完全剔除烟草中TSNAs 成为烟草行业的难题。

研究人员从育种、栽培、采收、调制、贮藏和加工等不同环节，对降低烟叶中TSNAs 进行了研究，获得了多种降低TSNAs 的方法。在遗传育种阶段，可通过基因手段，培育低生物碱和低特有亚硝酸盐的品种，可大幅度降低烟叶中TSNAs 含量（NNN 下降70%以上）[8]，但有些基因技术的植物代际间变异和遗传性需要进一步的验证[6-8]；在烟叶采后调制阶段，控制温湿度和改变烘烤条件可抑制TSNAs 的生成，可抑制TSNAs 累积达40%以上，但该措施需要特定的调制场所[4-5]；在醇化阶段，控制温湿度可抑制TSNAs 的升高[21]，但存在一定的成本问题；贮藏阶段施加抗氧化剂可降低TSNAs 的累积达20%[22]，但抗氧化剂存在自然氧化和影响口感问题；另有研究通过辐照技术降低烟草及卷烟中TSNAs[14-15]，但由于辐照源的使用限制和对烟草品质的不利影响，大大降低了辐照技术的工业应用效果。

贮藏期的烟叶pH 值为5～6，同时烟叶中含有亚硝酸盐和生物碱，大多数研究均证实贮藏期间烟叶中TSNAs 随着贮藏期的增加而逐渐升高[11-13]。文章研究结果也表明提高烟叶pH 值可减少贮藏期间TSNAs 的累积。因此，根据前期实验室研究，筛选出了提高烟叶pH 值的良好制剂（碳酸钠缓冲盐），在生产工艺允许条件下，最高施加体积设为烟叶干基重量的25%。另外，碱性过高会烧伤烟叶。1.5 mol/L 的碳酸钠缓冲液可使打叶复烤后的烟叶pH 值呈弱碱性状态（pH=7～8），故选择该浓度作为碳酸钠缓冲液的上限浓度。由于烟叶贮藏阶段TSNAs 逐渐升高，且前期升高较快，因此，选择打叶复烤环节进行碳酸钠缓冲液的施加，从而抑制贮藏阶段的TSNAs 累积。同时考虑到贮藏前期处理组pH 值下降较快，应在烟叶调制后尽快进行打叶复烤，缩短打叶复烤前的贮藏时间，从而抑制TSNAs 的快速生成。由于碳酸钠成本低廉，打叶复烤施加过程工艺简单，且抑制TSNAs 效果显著，因此，具有较好的工业应用性。

针对碳酸钠缓冲液处理过的烟叶，测定了烟叶外观、水分、烟叶化学成分和感官质量，进而评价碳酸钠缓冲液对烟叶品质的影响。经过碳酸钠缓冲液处理过的烟叶的颜色、光泽和颜色强度没有变化，也没有出现变暗或黑色，说明碳酸钠缓冲盐对烟叶的外观特征没有影响。在自然贮藏期间，同一仓库中的处理组烟叶水分高于对照组。这对贮藏于干燥环境的烟叶而言，有利于降低烟叶造碎，提高醇化质量。

贮藏开始时，处理组烟叶中的氨和总挥发碱含量低于处理组，这可能与碳酸钠缓冲液导致烟叶中氨和总挥发碱快速释放有关。随着贮藏时间的延长，氨和总挥发碱趋于稳定，且两种烟叶中氨含量、总挥发碱含量和总糖含量均呈现出高浓度处理组＜低浓度处理组＜对照组。研究证实，烟叶中氨和总挥发碱过多不利于感官质量，特别是总挥发碱含量与烟气刺激性呈显著正相关，烟叶中总挥发碱含量较低可以提高烟叶吸食的舒适性[23]。本实验证实经碳酸钠缓冲液处理过的烟叶，贮藏后的烟叶中氨含量和总挥发碱含量均低于对照组，这有利于降低吸食的刺激性。实验证实经碳酸钠缓冲液处理过的烟叶，贮藏后的烟叶中氨含量和总挥发碱含量均低于对照组，这有利于降低吸食的刺激性，这与感官评价结果较为一致。另外，由于晾晒烟中含糖量较低，在后期加工过程中需要添加大量的糖类，因此，总糖含量不作为碳酸盐影响晾晒烟叶品质的评判指标。

4 结论

在马里兰和白肋烟叶贮藏过程中，碳酸钠缓冲液具有调节烟叶pH 值的作用，碳酸钠缓冲液处理组烟叶中TSNAs 含量低于对照组，且施加25%（体积/烟叶干基重）1.5 mol/L 的碳酸钠缓冲液，具有显著抑制TSNAs 累积的效果。碳酸钠缓冲液处理过的烟叶外观与对照组无差异，烟叶含水率高于对照组，烟叶中总植物碱和总糖含量低于对照组，烟叶中氨、总挥发碱低于对照组，处理组烟叶感官质量评价总得分高于对照组，实验中采用的碳酸钠缓冲液对贮藏期间的烟叶品质未显示负面作用。