口服细胞穿膜肽Penetratin对小鼠肝脏、肾脏和肠道的急性毒性反应研究

魏振宇 李林 尉秀清

【摘要】目的 研究口服细胞穿膜肽Penetratin对小鼠肝脏、肾脏以及肠道的急性毒性反应，评估其安全性。方法 将24只Balb/c雄性小鼠随机分为正常对照组、低剂量组和高剂量组3组，每组各8只小鼠。各组小鼠均予正常饮食，其中正常对照组予200 μl生理盐水灌胃，低剂量组、高剂量组分别予200 μl由生理盐水配制的浓度为5、100 μmol/L的Penetratin灌胃。各组小鼠予不同处理24 h后收集标本，采集标本为小鼠的血液、肝脏、肾脏以及肠道组织，用生化法检测各组小鼠血清中ALT、AST、尿素氮、肌酐水平，用ELISA检测血清中二胺氧化酶（DAO）及脂多糖的含量，用实时荧光定量PCR方法检测肝脏、肾脏及肠道炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10的mRNA表达水平，用HE染色评估肝脏、肾脏以及肠道病理损伤情况，TUNEL法检测肝脏、肾脏以及肠道细胞凋亡情况。结果 各组小鼠的ALT、AST、尿素氮、肌酐水平、DAO及脂多糖含量、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10的mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）;與正常对照组对比，低剂量组和高剂量组各脏器均未见明显损伤及炎性细胞浸润，细胞凋亡无明显增多。结论 口服细胞穿膜肽Penetratin对小鼠的肝脏、肾脏以及肠道均无明显急性毒性反应，作为肠道促吸收剂安全性较好。

【关键词】细胞穿膜肽，Penetratin;组织损伤;炎症;细胞凋亡

【Abstract】Objective To observe the acute toxic reaction and evaluate the safety of oral cell-penetrating peptide Penetratin in mouse liver， kidney and intestine. Methods Twenty-four male Balb/c mice were randomly and evenly divided into the normal control， low-dose and high-dose groups. All mice in each group were given a normal diet. In the control group， the animals were gavaged with 200 μl of physiological saline. In the low-dose group， the mice were gavaged with 200 μl of Penetratin at a concentration of 5 μmol/L， and 200 μl of 100 μmol/L Penetratin was given in the high-dose group. The blood， liver， kidney and intestinal samples were collected 24 h later. The expression levels of ALT， AST， BUN， and Cr in the mouse serum in each group were measured by biochemical methods. The levels of diamine oxidase （DAO） and lipopolysaccharide （LPS） were detected by ELISA. The expression levels of inflammatory cytokines including TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-10 mRNA in each organ were detected by RT-PCR. The pathological injury of liver， kidney and intestinal tissues was evaluated by HE staining. The cellular apoptosis of each organ was detected by TUNEL staining. Results The expression levels of ALT， AST， BUN， Cr， the contents of DAO and LPS， and the expression levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-10  mRNA did not significantly differ among three groups （all P > 0.05）. Compared with the normal control group， no significant pathological injury or inflammatory cellular infiltration was observed and the cellular apoptosis was not significantly aggravated in the low-dose and high-dose groups. Conclusion Oral cell-penetrating peptide Penetratin yields no evident acute toxicity in mouse liver， kidney and intestine， and it can serve as a safe intestinal absorption enhancer.

【Key words】Cell-penetrating peptides，Penetratin;Tissue damage;Inflammation;Cellular apoptosis

细胞穿膜肽（CPP）是一类长度一般为5 ～ 30个氨基酸残基，能够携带大分子物质穿过细胞膜或组织屏障的短肽[1]。Penetratin是一种含有16个氨基酸（RQIKIWFQNRRMKWKK）的CPP，能够以不依赖能量的形式携带生物大分子有效地穿过细胞膜[2-3]。CPP可通过内吞或直接穿透等机制运载小分子、核酸、蛋白质、显影剂、药物等进入细胞内发挥其效应功能，具有生物相容性好、完成入胞转运后可降解、可定向设计和改造等优点，目前已经成为靶向治疗药物递送载体的研究热点[4]。国内外已有不少研究表明，将CPP与生物活性蛋白直接混合或利用基因工程技术进行重组融合表达，具有促进不吸收或低吸收药物的肠道吸收、皮肤渗透的作用[5-6]。

尽管CPP在生物医药领域展现出了广阔的应用前景，但是其安全性问题仍然不容忽视，目前尚缺乏口服Penetratin安全性的有力证据，本文拟通过研究口服Penetratin对小鼠肝脏、肾脏以及肠道的急性毒性反应，评估其安全性，为后续运用Penetratin作为肠道促吸收剂提供一定的实验支撑。

材料与方法

一、实验动物

无特定病原体（SPF） Balb/c小鼠24只，雄性，6 ～ 8周龄，体质量20 ～ 30 g，动物来源为江苏集萃药康生物科技有限公司，许可证号：SCXK（苏）2018-0008，动物合格证号：1107271911000884，饲养于暨南大学实验动物中心，实验单位使用许可证编号：SYXK（粤）2017-0174，动物实验伦理编号：IACUC-20191122-11。实验期间严格遵循实验动物中心的管理指南和行为规范，所有操作均符合实验动物伦理。

二、实验试剂和仪器

1.主要试剂

Penetratin（Glpbio，美国）、小鼠二胺氧化酶（DAO）ELISA試剂盒（MEIMIAN，上海）、小鼠脂多糖 ELISA试剂盒（MEIMIAN，上海）、Trizol 试剂盒（Thermo Fisher，美国）、逆转录试剂盒（Invitrogen，美国）、SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 酶（TOYOBO，日本）、HE染料 （Leagene，北京），TUNEL试剂盒（Servicebio，武汉）。

2.主要仪器

多功能酶标仪（美谷分子仪器，上海），紫外分光光度计（Thermo Scientific，美国），Light Cycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（Roche，美国），低温高速冷冻离心机（Eppendorf，德国），荧光倒置显微镜（Leica，德国）。

三、实验方法

1.实验动物的分组与干预

将24只经过暨南大学实验动物管理中心隔离检疫及适应性喂养10 d的Balb/c雄性小鼠随机分为正常对照组、低剂量组和高剂量组3组，每组各8只小鼠。各组小鼠均予正常饮食，正常对照组予200 μl生理盐水，低剂量组予200 μl由生理盐水配制的浓度为5 μmol/L的Penetratin，高剂量组予200 μl由生理盐水配制的浓度为100 μmol/L的Penetratin。给药方式均为灌胃，各组小鼠均给药1次，24 h后收集标本进行相应检测。

2. 标本的采集与处理

各组小鼠予相应干预24 h后，用1%戊巴比妥钠溶液对小鼠进行腹腔注射，充分麻醉后采用眼眶取血法将血液收集至提前备好的真空收集管中并做好标记，每个标本分装2管，室温静置1 h后离心收集血清，保存于-80℃冰箱备用;取血后对小鼠进行解剖，迅速分离取下肝脏、肾脏以及肠道组织，用液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用，待提取RNA用作后续检测，另取部分组织放入组织固定液中固定，用于制作石蜡标本。

3. 血液标本的检测

将此前保存于-80℃冰箱中的血清标本取出，1管送至广州剪刀手基因科技有限公司用生化法检测ALT、AST、尿素氮和肌酐水平，1管分别用小鼠DAO ELISA试剂盒、小鼠脂多糖 ELISA试剂盒检测DAO及脂多糖水平;每个样本做2个复孔。

4.组织细胞的RNA提取、cDNA逆转录及实时荧光定量PCR扩增

取出液氮中保存的组织，先按照Trizol试剂说明书的步骤对组织细胞中RNA的进行提取，并用紫外分光光度计测定提取的RNA 浓度及纯度，然后按照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录合成cDNA，选取β-actin为内参基因，通过Primerbank网站查找各目的基因以及内参基因的PCR引物序列，交由北京六合华大基因科技有限公司合成，应用 SYBR Green 法对TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10进行RT-PCR扩增。每组随机选取3只小鼠，每个样本做3个复孔，用2-△△CT法对数据进行相应处理，对正常对照组进行均一化处理后设定为相对数“1”，以此为参照分析相应炎症因子的相对mRNA表达水平。

5. HE染色

将石蜡切片，经过脱蜡和阶梯水化后，用苏木素染细胞核1 ～ 3 min，然后在流动的蒸馏水中洗去多余的染液，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，磷酸盐吐温缓冲液返蓝，流水冲洗，伊红复染30 ～ 60 s后进行漂洗，最后用中性树胶进行封片，在显微镜下采集图像。

6. TUNEL 检测及凋亡指数

参照操作说明书对各组织的切片进行染色，显色后阳性细胞在荧光显微镜下呈绿色。每张切片随机选取10 个高倍视野（×400），计算阳性细胞数和组织细胞总数，凋亡指数 = 阳性细胞数/组织细胞总数 ×100%。

四、统计学处理

应用SPSS 24.0进行统计学分析。计量资料以表示，多组间比较应用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组小鼠血液中ALT、AST、尿素氮、肌酐、DAO及脂多糖水平比较

对各组小鼠的各项血液生化指标进行统计归纳，通过单因素方差分析可知，正常对照组、低剂量组与高剂量组3组小鼠血清中ALT、AST、尿素氮、肌酐、DAO及脂多糖水平比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），见表1。

二、各组小鼠肝脏、肾脏、肠道组织中炎症因子的相对mRNA表达水平

从每组小鼠中随机选取3只小鼠对其相应脏器的RNA进行炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的RT-PCR扩增，对所得数据进行统计分析，各组小鼠相应脏器中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的相对mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），见表2、3、4。

三、各组小鼠肝脏、肾脏、肠道组织的病理损伤评估

各组小鼠的肝脏HE染色情况：与正常对照组相比，低剂量组和高剂量组肝细胞无水肿、坏死，肝小叶结构完整，肝窦间隙正常，未见明显肝内淤血及炎性细胞浸润。肾脏HE染色情况：与正常对照组相比，低剂量组和高剂量组肾小球形态正常，无明显体积增大或细胞数增多，肾小管上皮细胞无水肿、坏死，系膜细胞无明显增多，未见明显淤血肿胀和炎症细胞浸润。肠道HE染色情况：与正常对照组相比，低剂量组和高剂量组小肠层次分明，绒毛形态正常，腺体结构清晰，无明显肿胀充血和上皮细胞脱落，固有层未见明显淋巴细胞、浆细胞浸润，见图1。

四、各组小鼠肝脏、肾脏及肠道的细胞凋亡情况

各组小鼠的肝脏TUNEL染色结果显示，正常对照组、低剂量组和高剂量组均未见TUNEL明显凋亡的阳性信号，未能计算凋亡指数，各组小鼠肝脏、肾脏及肠道的细胞凋亡并无显著性差异，见图2。

讨论

CPP的安全性问题是可能限制其临床应用的一大重要因素，主要包括免疫原性以及质膜擾动可能引起的细胞毒性问题等[7]。Penetratin作为CPP中的一种，其安全性也受到了广泛的关注。一些学者认为Penetratin作为肠道促吸收剂在转运目的蛋白或药物的同时，也可能促进肠道内的内毒素等有害物质的吸收，从而引起肝脏等脏器的损伤[8]。Nielsen等[9]通过动物实验对Penetratin可否引起小鼠的肝脏损伤进行了研究，结果表明Penetratin摄入对小鼠肝脏无明显毒性，但其并未对Penetratin的肾脏和肠道毒性以及Penetratin的剂量与其毒性反应是否相关作进一步研究。

在本次研究中，我们关注的焦点不仅仅是Penetratin的肝脏毒性，还包括其肾脏毒性和肠道毒性，肾脏和肝脏一样都是研究药物急性毒性反应和机体代谢的重要器官，而肠道作为直接与口服药物接触的第一道屏障，是本次研究必需关注的一个重要方面。除此之外，我们还关注Penetratin的剂量与其毒性反应是否相关，并通过设置了不同浓度的Penetratin处理组尝试加以探讨。

为研究Penetratin是否具有急性肝毒性，我们首先利用生化法检测了提示急性肝损伤的敏感指标ALT和AST，相应地，为研究其对肾脏和肠道是否具有急性毒性反应，反映急性肾脏损伤的敏感指标尿素氮和肌酐以及反映急性肠道损伤的敏感指标 DAO和脂多糖也被纳入了我们的检测之中。这些检测的结果显示，正常对照组与低剂量组和高剂量组之间的差异均无统计学意义，表明口服Penetratin并未对小鼠的肝脏、肾脏和肠道造成急性损伤。

我们又对肝脏、肾脏、肠道组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10进行RT-PCR扩增，并对其相对mRNA表达水平进行统计分析，得到了Penetratin未引起相应组织炎症的结果，也进一步证实了我们的结论。最后，为了能够更直观的观察正常对照组和不同处理组之间的相应脏器是否存在组织形态异常或细胞凋亡的差异，我们还对肝脏、肾脏和肠道组织进行了HE和TUNEL染色，通过观察比较我们发现，与正常对照组相比，低剂量组和高剂量组相应脏器均未见明显的病理改变，也未见明显的细胞凋亡增多，提示Penentratin未引起急性的组织损伤或凋亡。

综上所述，本研究通过对Penetratin高低剂量的设置，采用反映不同脏器急性毒性损伤和炎症反应的敏感指标，并结合直观的组织改变和细胞凋亡情况，比较系统地证实了口服Penetratin对小鼠的肝脏、肾脏以及肠道均无明显急性毒性反应，其作为肠道促吸收剂的安全性良好，这无疑为后续研究的开展奠定了坚实的基础。但必须指出的是，仅仅研究口服Penetratin对小鼠肝脏、肾脏以及肠道的急性毒性反应还存在着一定的局限性，下一步我们将继续利用动物实验对口服Penetratin的慢性毒性进行研究，以期对其作为肠道促吸收剂的安全性作出更为全面和整体的评估。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-12-18）

（本文编辑：杨江瑜）