DNA异常甲基化在溃疡性结肠炎中的作用研究进展

施飞熊 张桂虾 周宇

【摘要】溃疡性结肠炎（UC）致病机制尚未明确，可能与遗传、免疫及环境等多种因素有关。DNA甲基化在调节基因转录并在发育、分化和基因组稳定性中起重要作用。DNA异常甲基化既是肠道慢性炎症的一个结果，同时也可能在UC的发生发展中发挥作用。该文对DNA异常甲基化在UC中可能存在的机制及其临床意义等方面进行综述。

【关键词】溃疡性结肠炎;DNA甲基化;肠道慢性炎症

【Abstract】The pathogenesis of ulcerative colitis （UC） remains elusive， which is probably correlated with multiple factors， such as heredity， immunity and environment， etc. DNA methylation plays an important role in regulating gene transcription， development， differentiation and genomic stability. Aberrant DNA methylation is not only a consequence of chronic intestinal inflammation， but also may play a role in the occurrence and development of UC. In this article， the possible mechanism and clinical significance of aberrant DNA methylation in UC were reviewed.

【Key words】Ulcerative colits;DNA methylation;Chronic intestinal inflammation

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性肠道炎症性疾病，其在我国的发病率呈逐年上升趋势，然而其发病机制目前仍不完全清楚，治疗效果欠佳。DNA甲基化在调控正常细胞过程的基因表达中起着关键作用。近来越来越多研究表明异常DNA甲基化与UC的发生发展相关。有些基因的甲基化程度与UC的非典型增生甚至与UC相关结肠癌有关，而另一些基因在UC与其他疾病中甲基化程度差异较大甚至仅在UC中发生异常甲基化。因此明确UC中发生的DNA异常甲基化对UC的诊断、治疗及预防等方面具有重要意义。本文主要讨论了DNA异常甲基化与UC的关系、DNA甲基化在UC作用的可能机制及临床意义。研究UC中DNA异常甲基化有望为UC提供新的血清学标志物及治疗靶点。

一、DNA甲基化的功能与作用

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，可能受饮食、疾病和吸烟等环境因素影响。DNA甲基化有建立（从头DNA甲基化）、维持和去甲基化等3个阶段，可调节基因转录并在發育、分化和基因组稳定性中起作用。DNA甲基化在哺乳动物基因组中普遍存在，尽管存在一些组织特异性差异，但哺乳动物基因组70% ～ 80%的CpG发生甲基化[1]。甲基化由DNA甲基转移酶进行，在此过程中，甲基被共价加到胞嘧啶上，产生5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中，DNA主要在CpG二核苷酸处发生甲基化。CpG岛（CGI）是相对较小的基因组区域，平均约为1 Kb，通常存在于组成型表达基因和组织特异性基因的启动子区域中。除CGI外，哺乳动物的基因组通常是低CpG的。超过三分之二的哺乳动物启动子是CGI，并且几乎所有的管家基因都有CGI启动子。

DNA甲基化和基因沉默之间的相关性与启动子CpG二核苷酸密度成正比。然而其具体转录抑制的机制尚未明确。研究发现，转录因子易接近的染色质区域通常存在低甲基化或未甲基化，而单个低甲基化区域可作为增强子，增加启动子的活性，代表活跃的调节区。此外，转录因子在未甲基化和低甲基化区域皆表现富集情况。上述证据表明转录因子的结合与DNA甲基化互斥，故DNA甲基化可能通过阻碍转录因子与启动子区结合从而导致转录抑制[2]。但是甲基化的DNA基序也可能为其他转录因子创造新的结合位点，被特异性识别而起作用。例如DNA甲基化可以通过含有甲基CpG结合域的转录抑制因子来读取。还有，DNA甲基化序列也可以被转录激活因子特异性识别。研究发现，人类和小鼠表达数十种具有特定甲基化序列结合偏好的转录因子，许多转录因子更易与CpG甲基化序列结合，其中大多数在扩展的同源结构域家族中[3]。DNA甲基化作为一种控制基因表达的手段具有至关重要的作用。例如DNA甲基化在X染色体失活中起关键作用。在雌性哺乳动物的发育过程中，每个细胞中的一个活性X染色体被非编码RNA X非活性特异转录物（XIST）随机沉默。X连锁的CGI发生甲基化相对较晚，并且在基因已经沉默之后起到最终锁定的作用，最终导致X染色体失活[4]。此外，异常DNA甲基化是许多疾病的特征，包括各种类型的癌症及炎症性疾病，异常的启动子CGI甲基化正成为疾病检测、诊断和预后的潜在生物标志物[5]。

二、DNA异常甲基化与UC密切相关

大量研究表明，UC是由多个基因的遗传易感性与免疫、环境因素的异常相互作用引起。UC相关基因甲基化状态变化可以显著改变基因表达水平，可能导致疾病发生和发展[6]。有研究显示，将UC初次治疗患者（n = 10）及健康对照组（n = 11）的全基因组DNA甲基化测序对比分析，结果显示在DNA甲基化差异基因中有25个基因已被证实为炎症性肠病（IBD）易感基因，其中6个基因在其TSS具有CGI[7]。30%的基因CpG位点甲基化靠近转录起始位点，并且约25%显著差异表达基因与DNA甲基化类型相关。因此说明，UC中存在其相关基因的CpG位点甲基化，可能与UC的发生发展有关。

DNA甲基化和消化道的炎症状态密切相关，慢性炎症通过诱导肠道上皮细胞DNA异常甲基化参与UC发生发展，提示DNA甲基化是慢性炎症的一个结果[8]。IFN-γ的表达不仅对炎症的发展和维持至关重要，而且在IBD发病机制及IBD风险区域侧翼IFN-γ基因（IFNG）发挥重要作用。有研究发现，第3个IFNG内含子区域发现一个新单核苷酸多态性（SNP）位点rs1861494 T/C[9]。该SNP位点同时也为CpG甲基化引入新位点。进一步研究显示，特定的等位基因序列和甲基化水平均可调节转录因子与rs1861494区域的结合，从而调节IFN-γ的表达。T至C的取代引入新的CpG二核苷酸序列，新位点的甲基化与IFN-γ表达降低相关。

对UC炎症活动性相关的45个高甲基化基因进行聚类分析结果提示，在UC患者中活动期炎症黏膜较非活动期炎症黏膜其相关基因表现出更高的甲基化水平[10]。但上述高甲基化基因与UC病程并无相关性，可能与仅对其炎症黏膜活动期和非活动期区分，而未区分是否发生非典型增生或癌变有关。研究表明，与无非典型增生相比，UC患者的非典型增生和周围无非典型增生的肠道黏膜DNA甲基化增加[8]。

由于炎症中较高的细胞更新，所以UC可被视为一种组织过早老化的疾病。而一些基因在非肿瘤组织中因老化而发生并加速甲基化，这类改变称为年龄相关甲基化[8]。研究发现，SOX17、CDH13、DPYS、MLF1、SOX11、GDNF、N33和SCL16A12等基因在UC中甲基化程度加速，且与较长的UC病程相关，认为炎症持续时间比当前炎症程度更重要。另外，此研究还发现DPYS、N33在肿瘤性UC组织及近瘤组织中甲基化程度更高[11-12]。一些年龄相关甲基化基因ER、MYOD、p16外显子1和CSPG2在UC中甲基化程度与不典型增生程度正相关[11]。

三、DNA甲基化在UC作用的可能机制

DNA甲基化异常包括全基因组的低甲基化和局部基因的高甲基化。根据基因功能不同，其甲基化类型也不同。参与内环境稳态及防御的基因观察到高甲基化，而与免疫应答相关基因则观察到低甲基化[13]。在黏膜炎症过程中，上皮细胞的比例减少，导致肠通透性受损和体内平衡失调。这可能是由于富含脯氨酸的酸性蛋白1和参与维持上皮细胞内稳态的溶质载体蛋白家族成员SLC6A19和SLC3A1的高甲基化和表达下调所致。此外，参与肠道黏膜防御系统的基因也检测到高甲基化。肠道碱性磷酸酶1和防御素B1与上皮表面对微生物定植的抵抗力有关，而UDP葡萄糖醛酸基转移酶家族UGT1A10和UGT1A8与限制胃肠黏膜通过细胞色素P450系统对有害化学物质的消化吸收有关，这些基因在UC中均出现高甲基化。同时参与胃肠液和电解质平衡的鸟苷酸环化酶激活剂GUCA2A和GUCA2B也检测到高甲基化，这可能与其在炎症中下调有关。此外，所检测到UC相关低甲基化且在UC中上调的基因，大多数与先天免疫系统相关，例如趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、IL和转运蛋白。此研究也发现，BTNL3、DEFA、OLFM4和REG1B存在非CpG甲基化，而这些基因不仅参与炎症反应及可能与抗菌活性有关，也参与大肠癌的发生发展。然而非CpG甲基化机制尚未明确，需待进一步研究和证实。

上皮-间质转换（EMT）与UC的发病机制相关[14]。EMT是黏附上皮细胞转化为间充质细胞表型的一种现象，能增强细胞的侵袭和迁移能力。研究发现EMT相关基因CDH1和CDH13启动子甲基化和患者年龄显著相关，并且与UC病程具有相同趋势。说明EMT相关基因启动子甲基化与UC的发病过程有关。

四、DNA甲基化在UC中的临床意义

DNA甲基化在各种疾病包括UC的诊断及治疗上均有一定意义[15]。有研究发现，KIAA1614、RIBC2和FAM217B这3个基因在UC中高度甲基化，认为检测其甲基化情况可能作为UC诊断和治疗的潜力标志物[10]。一些基因的启动子CGI仅在严重表型UC发生甲基化，它们所编码的蛋白质通常参与生物合成、代谢调节及氮化合物代谢过程，如ZNF582、ZNF614、ZNF274、ZNF583和ZNF559等基因，并且部分基因已被报道在其他肿瘤中发生高甲基化[12]。此外据文献报道，CDX1、miR-1247高甲基化与UC难治性表型正相关，miR-1247、CDH1高甲基化与较严重Mayo内镜评分相关[14]。据报道，UC中RAS相关结构域家族成员1转录变异体A（RASSF1A）基因甲基化明显高于克罗恩病，因此认为RASSF1A基因甲基化可能作为临床鉴别UC与克罗恩病的指标之一[16]。研究显示，Uhrf1基因的缺乏和突变均使葡聚糖硫酸钠（DSS）处理小鼠的肠道炎症加重，其原因是肠道巨噬细胞Uhrf1可介导TNF-α启动子的甲基化，因此开发Uhrf1介导TNF-α启动子的甲基化，使TNF-α对UC患者肠道组织损伤作用的减弱，为UC治疗开拓新的思路[17]。某些基因的甲基化与UC相关结肠癌有关，这为临床提示UC癌变提供预测指标。有研究发现，在结肠癌细胞HCT-116中过表达miR-34b-5p可显著降低细胞增殖、集落形成和侵襲能力，而进一步研究发现miR-34b-5p在UC相关性结肠癌中低表达的原因之一是启动子发生高甲基化，因此通过检测UC组织中是否出现miR-34b-5p高度甲基化，可能提示UC是否出现癌变[18]。也有研究者分析UC相关结直肠癌患者结肠上皮CpG位点DNA甲基化水平，结果发现促肾上腺皮质激素释放激素受体2（CRHR2）在癌与非癌黏膜组织的甲基化水平差异最大，提示CRHR2基因高甲基化检测有可能用于UC患者的肿瘤筛查[19]。总之，有些基因的甲基化程度与UC的非典型增生甚至癌变相关，这不仅为病理及内镜下对病变的诊断和鉴别诊断提供重要的依据，而且还为UC的早期手术治疗提供新指征。而另一些基因仅在严重表型UC患者中呈现高度甲基化，这对该类UC治疗提供新的方向。

不少研究证实UC的发生发展与肠道菌群有关，并且可以通过菌群移植治疗UC[20-21]。然而肠道菌群对DNA异常甲基化是否有影响？有研究发现，通过用环丙沙星、甲硝哒唑、新霉素和万古霉素等抗生素治疗DSS及氧化偶氮甲烷（AOM）鼠UC模型，结果显示已增生的黏膜结节数量减少、直径减小，由DSS及AOM诱导基因甲基化效应减弱，Cbln4、Fosb和Msx1的CGI甲基化增加程度被抑制约50% ～ 92%[22]。同时炎症相关基因Nos2表达被显著抑制，TNF呈现下降的趋势。由此说明，通过抗生素调控肠道特定菌群不仅可以缓解UC的肠道炎症，也可以抑制UC的癌变，说明抗生素治疗UC具有一定可行性，同时也说明UC相关基因CGI甲基化参与这一过程。

最近研究表明，唾液具有替代上皮黏膜来进行DNA甲基化研究的潜力。将唾液和肠道黏膜中的DNA甲基化谱进行比对，结果显示唾液和肠道黏膜的全局DNA甲基化在个体内呈正相关。唾液作为一种高质量甲基化谱，相比肠道黏膜具有无创、易收集的显著优势[23]。但是唾液是否可以完全取代肠道黏膜对UC患者DNA异常甲基化的检测，尚需进一步研究。

五、展 望

UC是以慢性炎症为特征的一种疾病，而DNA异常甲基化不仅是慢性炎症的结果，也能促进肠道炎症，与严重表型UC相关。DNA异常甲基化既是因又是果，与UC的发生、发展密切相关，并随着UC病程的增加及异常甲基化基因的增加，使UC向UC相关大肠癌演变。那么如何检测及阻止DNA异常甲基化对治疗UC及预防癌变尤为重要。总而言之，在UC病因机制的研究及诊断和治疗途径的拓展等方面，或许DNA甲基化担任更加重要的角色。

参 考 文 献

[1] Greenberg MVC， Bourchis D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol，2019，20（10）：590-607.

[2] Stadler MB， Murr R， Burger L， Ivanek R， Lienert F， Sch?ler A， van Nimwegen E， Wirbelauer C， Oakeley EJ， Gaidatzis D， Tiwari VK， Schübeler D. DNA-binding factors shape the mouse methylome at distal regulatory regions. Nature，2011，480 （7378）：490-495.

[3] Yin Y， Morgunova E， Jolma A， Kaasinen E， Sahu B， Khund-Sayeed S， Das PK， Kivioja T， Dave K， Zhong F， Nitta KR， Taipale M， Popov A， Ginno PA， Domcke S， Yan J， Schübeler D， Vinson C， Taipale J. Impact of cytosine methylation on DNA binding specificities of human transcription factors. Science，2017，356（6337）. pii： eaaj2239.

[4] Zhu H， Wang G， Qian J. Transcription factors as readers and effectors of DNA methylation. Nat Rev Genet，2016，17（9）：551-565.

[5] 范銳心，张作文，朱惠莲. DNA甲基化和动脉粥样硬化研究进展.中山大学学报（医学科学版），2006，27（s2）：213-216.

[6] Lin Z， Hegarty JP， Cappel JA， Yu W， Chen X， Faber P， Wang Y， Kelly AA， Poritz LS， Peterson BZ， Schreiber S， Fan JB， Koltun WA. Identification of disease-associated DNA methylation in intestinal tissues from patients with inflammatory bowel disease. Clin Genet，2011，80（1）：59-67.

[7] Taman H， Fenton CG， Hensel IV， Anderssen E， Florholmen J， Paulssen RH. Genome-wide DNA methylation in treatment-na?ve ulcerative colitis. J Crohns Colitis，2018，12（11）：1338-1347.

[8] Tahara T， Shibata T， Nakamura M， Okubo M， Yamashita H， Yoshioka D， Yonemura J， Hirata I， Arisawa T. Association between polymorphisms in the XRCC1 and GST genes， and CpG island methylation status in colonic mucosa in ulcerative colitis. Virchows Arch，2011，458（2）：205-211.

[9] Gonsky R， Deem RL， Landers CJ， Haritunians T， Yang S， Targan SR. IFNG rs1861494 polymorphism is associated with IBD disease severity and functional changes in both IFNG methylation and protein secretion. Inflamm Bowel Dis，2014，20（10）：1794-1801.

[10] Kang K， Bae JH， Han K， Kim ES， Kim TO， Yi JM. A genome-wide methylation approach identifies a new hypermethylated gene panel in ulcerative colitis. Int J Mol Sci，2016，17（8）. pii： E1291.

[11] Issa JP， Ahuja N， Toyota M， Bronner MP， Brentnall TA. Accelerated age-related CpG island methylation in ulcerative colitis. Cancer Res，2001，61（9）：3573-3577.

[12] Tahara T， Hirata I， Nakano N， Nagasaka M， Nakagawa Y， Shibata T， Ohmiya N. Comprehensive DNA methylation profiling of inflammatory mucosa in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis，2017，23（1）：165-173.

[13] Taman H， Fenton CG， Hensel IV， Anderssen E， Florholmen J， Paulssen RH. Genome-wide DNA methylation in treatment-na?ve ulcerative colitis. J Crohns Colitis，2018，12（11）：1338-1347.

[14] Tahara T， Shibata T， Okubo M， Ishizuka T， Nakamura M， Nagasaka M， Nakagawa Y， Ohmiya N， Arisawa T， Hirata I.DNA methylation status of epithelial-mesenchymal transition （EMT）--related genes is associated with severe clinical phenotypes in ulcerative colitis （UC）. PLoS One，2014，9（10）：e107947.

[15] 周原， 陆才德. DNA甲基化作为诊断标记物在胰腺癌诊断中的研究进展. 新医学， 2016，47 （6）：349-353.

[16] Salama RH， Sayed ZEA， Ashmawy AM， Elsewify WA， Ezzat GM， Mahmoud MA， Alsanory AA， Alsanory TA.Interrelations of apoptotic and cellular senescence genes methylation in infla-mmatory bowel disease subtypes and colorectal carcinoma in egyptians patients. Appl Biochem Biotechnol，2019，189（1）：330-343.

[17] Qi S， Li Y， Dai Z， Xiang M， Wang G， Wang L， Wang Z. Uhrf1-mediated TNF-α gene methylation controls Proinflammatory macrophages in experimental colitis resembling inflammatory bowel disease. J Immunol，2019，203（11）：3045-3053.

[18] Yang C， Lu W， He H， Liu H. Inflammation and DNA methylation-dependent down-regulation of miR-34b-5p mediates c-MYC expression and CRL4DCAF4 E3 ligase activity in colitis-associated cancer. Am J Pathol，2020，190（3）：674-688.

[19] Kobayashi M， Matsubara N， Nakachi Y， Okazaki Y， Uchino M， Ikeuchi H， Song J， Kimura K， Yasuhara M， Babaya A， Yamano T， Ikeda M， Nishikawa H， Matsuda I， Hirota S， Tomita N. Hypermethylation of corticotropin releasing hormone receptor-2 gene in ulcerative colitis associated colorectal cancer. In Vivo，2020，34（1）：57-63.

[20] Schirmer M， Denson L， Vlamakis H， Franzosa EA， Thomas S， Gotman NM， Rufo P， Baker SS， Sauer C， Markowitz J， Pfefferkorn M， Oliva-Hemker M， Rosh J， Otley A， Boyle B， Mack D， Baldassano R， Keljo D， LeLeiko N， Heyman M， Griffiths A， Patel AS， Noe J， Kugathasan S， Walters T， Huttenhower C， Hyams J， Xavier RJ. Compositional and temporal changes in the gut microbiome of pediatric ulcerative colitis patients are linked to disease course. Cell Host Microbe，2018，24（4）：600-610.e4.

[21] Shen ZH， Zhu CX， Quan YS， Yang ZY， Wu S， Luo WW， Tan B， Wang XY. Relationship between intestinal microbiota and ulcerative colitis： mechanisms and clinical application of probiotics and fecal microbiota transplantation. World J Gastroenterol，2018，24（1）：5-14.

[22] Hattori N， Niwa T， Ishida T， Kobayashi K， Imai T， Mori A， Kimura K， Mori T， Asami Y， Ushijima T. Antibiotics suppress colon tumorigenesis through inhibition of aberrant DNA methy-lation in an azoxymethane and dextran sulfate sodium colitis model. Cancer Sci，2019，110（1）：147-156.

[23] Langie SA， Szarc Vel Szic K， Declerck K， Traen S， Koppen G， Van Camp G， Schoeters G， Vanden Berghe W， De Boever P. Whole-genome saliva and blood DNA methylation profiling in individuals with a respiratory allergy. PLoS One，2016，11（3）：e0151109.

（收稿日期：2019-11-21）

（本文編辑：杨江瑜）