慢性社会挫败应激对小鼠海马兴奋-抑制平衡和认知功能的影响☆

牛伟盼 张月 王瀚 李继涛 司天梅 苏允爱○☆

慢性应激是抑郁症的重要诱发因素，慢性社会挫败应激模型是研究抑郁症病理机制的有力工具[1]。既往研究发现，成年期的慢性社会挫败应激可引起啮齿类动物大脑结构和功能改变，导致认知功能损害[2]。但是慢性应激引起认知功能损害的机制尚不清楚。近年研究强调，大脑内由谷氨酸和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）介导的兴奋-抑制神经传递平衡是大脑可塑性形成和维持的重要基础[3]。如果这个平衡被打破则会诱发包括抑郁症等多种神经精神疾病[4-5]，而这种兴奋-抑制失衡是否参与慢性社会挫败应激诱发的认知功能损害，尚没有研究。海马是产生和调节情绪、动机及调控学习记忆等认知功能的关键脑区，同时也是对应激敏感的脑区之一[6]。因此本研究旨在观察慢性社会挫败应激对小鼠依赖海马的认知功能和对海马兴奋-抑制平衡的影响，探讨应激相关认知功能障碍及MDD的分子病理机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年8周龄C57BL/6N雄性小鼠（n=20）和成年雄性退役 CD1 小鼠（n=25，21 只用于造模，4只用于社交回避实验）购自北京维通利华公司。C57小鼠按体重随机分为应激组（n=10）与对照组（n=10）。本研究所有操作获得北京大学动物伦理委员会批准。

1.2 建立慢性社会挫败应激模型 参考WAGNER等[7]慢性社会挫败应激模型的实验范式。雄性CD1小鼠（体重40 g以上）单笼饲养2周以上，并筛选出具有强攻击性（发起攻击的潜伏期＜30 s）的小鼠用于造模。过程如下：每日将应激组小鼠放入陌生CD1小鼠的饲养笼中，发生攻击行为后，将C57小鼠继续暴露于CD1小鼠30 s，随后将C57与CD1小鼠用金属孔板隔开，使2只小鼠保持视觉、嗅觉等接触，但避免躯体接触。C57小鼠每天面对不同的攻击鼠，应激持续21 d。每日评估应激组小鼠是否发生严重的躯体损害，如有发生予以剔除。对照组小鼠按照正常条件单笼饲养。

1.3 社交回避实验 采用该实验考察应激是否导致小鼠出现社交回避等抑郁样行为，评估模型的表面效度。测试分为两个阶段：熟悉阶段，在实验箱侧壁中央放入一个空笔筒，将笔筒周围20 cm×25 cm的区域设置为实验小鼠和CD1小鼠的互动区域，视频跟踪实验小鼠2.5 min；互动阶段，将1只陌生CD1小鼠放入笔筒，视频跟踪2.5 min，考察实验鼠与CD1小鼠的互动时间。计算实验鼠互动期与熟悉期在互动区域逗留的时间比值作为社交指数。如果社交指数大于1，提示小鼠具有社交互动行为。

1.4 空间物体辨别实验 利用小鼠对新位置物体好奇的生物习性来评估小鼠对物体空间位置信息的记忆能力，考察应激是否损害小鼠依赖海马的认知行为。测试分为熟悉期和辨别期：熟悉期时，在测试箱内放入两个相同铝制正方体，小鼠熟悉物体，视频跟踪10 min；间隔60 min后进入辨别测试期，改变其中一个物体的位置，放入小鼠，视频跟踪10 min。采用偏爱指数反映小鼠的再认记忆能力，即探索新位置物体时间占探索两个物体总时间的比值。

1.5 免疫组化染色 采用免疫组化法检测小鼠海马囊泡性谷氨酸转运体1（vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1）、囊泡性 γ-氨基丁酸转运体（vesicular GABA transporter，VGAT）、 小 清 蛋 白（parvalbumin，PV）表达量及小清蛋白阳性中间神经元 （parvalbumin positive interneurons，PVIs） 密 度 。行为学实验结束24 h后，每组随机取5只小鼠，进行麻醉、灌注、取脑。采用连续冠状切片，厚度为30 μm。选取包含前囟点向后1.46～2.18 mm的范围，脑片之间间隔180 μm。采用漂片法进行免疫组化染色，分别加入兔源VGLUT 1（1:10000,Synaptic Systems， 德 国 ）、VGAT （1:500，Synaptic Systems，德国）、PV（1:20000，SWANT,瑞士）在 4 ℃下孵育24 h。次日与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（中杉金桥，中国）室温孵育90 min，完成DAB显色和脱水透明封片。运用ImageJ软件分析海马不同亚区目的蛋白平均光密度值及计算PVIs密度。每只小鼠每个亚区结果为3～4个完整脑片的平均结果。

1.6 统计学方法 采用SPSS 24.0进行统计学分析。小鼠社交指数不符合正态分布，组间比较采用Mann-Whitney U检验。探索物体时间、海马中目的蛋白表达量及PVIs密度等为正态分布，组间比较用独立样本t检验，同一组内数据比较采用配对样本t检验。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 社交互动行为与空间物体辨别记忆

2.1.1 社交回避实验 应激组小鼠的社交互动行为减少，社交指数均小于1，且低于对照组（Z=3.19，P＜0.01，表 1）。

2.1.2 空间物体辨别实验 在辨别期，对照组小鼠探索新位置物体的时间比值高于旧位置物体（t=3.68，P＜0.01）；而应激组小鼠对新、旧位置物体的探索时间比值无统计学差异（t=0.10，P=0.95）。应激组的偏爱指数低于对照组（t=2.38，P＜0.01，表 1）。 两组小鼠探索新旧位置物体的总时间无统计学差异（t=0.86，P=0.64，表 1）。

2.2 海马突触水平上兴奋-抑制平衡

2.2.1 VGLUT1表达量 应激组海马齿状回（dentate gyrus，DG）VGLUT1 表达量低于对照组 （t=3.78，P＜0.01），而应激组与对照组小鼠 CA1 区（t=1.77，P=0.11）和 CA3 区（t=1.36，P=0.21）VGLUT1表达量无统计学差异（图1，表2）。

2.2.2 VGAT表达量 应激组海马CA3区VGAT表达量低于对照组（t=3.78，P＜0.01），而应激组与对照组 CA1（t=0.94，P=0.38）和 DG 区（t=0.84，P=0.42）VGAT表达量无统计学差异（图2，表2）。

2.2.3 VGLUT1/VGAT比值 应激组海马CA3区VGLUT1/VGAT的比值高于对照组 （t=5.21，P＜0.01），而应激组与对照组 CA1（t=1.58，P=0.15）和DG 区（t=0.46，P=0.66）的 VGLUT1/VGAT 比值无统计学差异（表2）。

2.3 海马PV蛋白表达量及PVIs密度

2.3.1 PV蛋白表达量 应激组海马DG区 （t=3.25，P=0.01）与 CA3 区（t=4.09，P＜0.01）PV 蛋白表达量低于对照组，而应激组与对照组CA1区（t=0.33，P=0.75）的PV蛋白表达量无统计学差异（图3，表 3）。

2.3.2 PVIs密度 应激组海马 DG区 （t=3.61，P=0.05）和 CA3 区（t=6.20，P＜0.01）PVIs密度低于对照组，DG区和CA3区分别降低约36.2%与25.8%，而应激组与对照组CA1区 （t=0.61，P=0.11）PVIs密度无统计学差异（图 3，表 3）。

3 讨论

表1 慢性社会挫败应激对小鼠社交互动行为及空间物体辨别记忆的影响

本研究发现持续3周慢性社会挫败应激导致小鼠出现社交回避行为，提示应激组小鼠存在抑郁样行为，表明该模型可以在一定程度上模拟MDD。在空间物体辨别任务中，对照组小鼠探索新位置物体的时间比值高于旧位置物体，提示小鼠对新位置物体有偏好；应激组小鼠对新位置物体的探索时间比值与对旧位置物体的探索时间比值无统计学差异，提示其不能辨别出新、旧位置的物体。此外，应激组的偏爱指数低于对照组，表明慢性社会挫败应激损害小鼠对空间物体位置的辨别能力，破坏了依赖海马的认知行为。本研究发现慢性社会挫败应激可引起小鼠出现抑郁样行为与依赖海马的认知功能损害，与既往研究结果一致[8-9]。

表2 慢性社会挫败应激对小鼠海马突触水平上兴奋-抑制平衡的影响

图1 应激组和对照组海马区VGLUT1免疫组化染色图例 海马冠状切片图标尺=200μm，亚区图标尺=50μm

图2 应激组和对照组海马区VGAT免疫组化染色图例 海马冠状切片图标尺=200μm，亚区图标尺=50μm

表3 慢性社会挫败应激对海马PV表达量及PVIs密度的影响

图3 应激组合对照组海马区PV蛋白免疫组化染色图例 海马冠状切片图标尺=200μm，亚区图标尺=50μm

在神经生物学水平上，本研究关注大脑兴奋性与抑制性突触的特异性标记物VGLUT1和VGAT。它们分别位于兴奋性和抑制性突触囊泡中，特异性地装载谷氨酸或GABA进入突触囊泡并促进其释放入突触间隙，并通过影响囊泡充盈程度和数量，对兴奋/抑制神经传递平衡的调节发挥重要作用[10-11]。本研究发现慢性社会挫败应激降低DG区VGLUT1和CA3区VGAT表达水平，升高CA3区VGLUT1/VGAT比值，提示海马区出现突触水平上的兴奋-抑制失衡，呈现过度兴奋状态。这与既往研究发现结果相一致，如GAO等[12]与VAN DER KOOIJ等[13]均发现慢性束缚应激引起大鼠海马脑区兴奋-抑制平衡改变，其海马呈兴奋状态。

为进一步研究这种失衡是否与抑制性中间神经元有关，本研究聚焦于PVIs。PVIs是研究最多的抑制性中间神经元之一，它表达特异性钙结合蛋白——PV，并具有快放电的特性。它在维持正常兴奋-抑制平衡和高频神经元同步化活动中起着关键作用[14]。本研究发现慢性社会挫败应激下调DG和CA3区PV蛋白表达水平及PVIs的密度，提示海马区突触水平上的兴奋-抑制失衡可能与PVIs下调有关。既往研究发现，慢性轻度应激、隔离应激、束缚应激均可减少大鼠海马所有亚区PVIs的数量[15-17]。本研究仅发现小鼠海马DG和CA3区PV蛋白表达水平及PVIs密度下降，与文献结果不完全一致，这可能与研究使用的应激范式及动物种系不同有关。

本研究从基础研究的角度提示海马区兴奋-抑制失衡可能参与应激导致的认知功能损害。这有助于进一步理解应激相关认知损害及MDD的病理机制，为今后的MDD药物治疗开发提供实验依据。

本研究用VGLUT1/VGAT比值和PVIs密度改变来反映海马兴奋-抑制失衡具有一定的局限性，今后研究可利用电生理技术检测兴奋性或抑制性神经元的功能来直接反映兴奋-抑制平衡的变化。此外，由于本研究中神经生物学实验的样本量较少，未能对行为与分子改变进行相关分析，今后需对两者之间的关系做进一步研究。