星豹蛛CYP3313A3 基因克隆与生物信息学分析

任彦鸿，王雅丽，赵瑞，燕晶晶，田国强，李锐

（山西农业大学农学院，山西太谷，030801）

蛛形纲动物是农田生态系统的重要组成部分，除了少数蜱螨亚纲等是重要的田间害虫外，其余多为捕食性蜘蛛，其中星豹蛛（Pardosa astrigera）属狼蛛科（Lycosidae）豹蛛属（Pardosa），在我国广泛分布，是一种游猎型蜘蛛，具有食量大、耐饥饿、习性凶猛等特点［1～3］，可以捕食蚜虫、玉米螟、棉铃虫、粘虫等的幼虫，是一种重要的田间捕食性天敌优势种［4，5］。

细胞色素 P450（Cytochrome P450）是一类广泛分布于生物体内的重要血红素结合蛋白，同时也是一种混合功能氧化酶系［6］，该酶系通过单加氧作用使代谢废物或外源物失活，属于单氧酶的一种，在波长450 nm 处有最大吸收峰值，其名称也由此而来［7～9］。

细胞色素P450 在昆虫领域已有大量研究，但对天敌蜘蛛的研究鲜见报道。本课题组通过转录组测序鉴定出66 条细胞色素P450 基因，其中23 条属于 CYP2 家族，11 条属于 CYP3 家族，17 条属于CYP4 家 族 ，其 余 15 条 属 其 他 家 族 ，经 GO 和KEGG 显著富集进一步分析预测其中5 条基因与外源物代谢有关［10］，在此基础上，本文选取其中1条基因，利用RT-PCR 技术克隆得到该基因并命名为CYP3313A3，并通过生物学软件等对该基因进行生物学分析，旨在为深入研究细胞色素P450基因提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

星豹蛛（Pardosa astrigera）采自山西农业大学农作站（37°26′ N，111°32′ E），置于小试管中单头饲养，并在管内放置湿棉球保湿，培养环境为人工气候箱（T=（29±1）℃，RH=（50±5）%，L∶D=16∶9，上海一恒仪器有限公司），以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为主要食物，每次饲喂5 头黑腹果蝇，隔天投喂1 次。

黑腹果蝇于室外水果诱集，室内玉米粉培养基培养。培养基配方（单份）为：琼脂1.4 g，白糖10 g，玉米粉 14 g，蒸馏水 120 mL 丙酸（AR）0.8 mL。

1.2 主要试剂

BIOZOL 总RNA 提取试剂：杭州博日科技有限公司；反转录试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、胶回收试剂盒和pGM-Simple-T Fast Cloning 试剂盒：北京天根生化科技有限公司。

1.3 星豹蛛总RNA 的提取及cDNA 的合成

星豹蛛总RNA 的提取方法参考BIOZOL 试剂说明书进行，经超微量核酸蛋白测定仪（Scandrop200，德国）检测。cDNA 的合成参考试剂盒说明书进行，-20 ℃保存备用。

1.4 CYP3313A3 基因克隆

以合成的星豹蛛cDNA 为模板，通过设计引物 ：F：5′-AGTGCAAAAACTATTTTTGATA ATCCAATAAATTCTA；R：TTCTAATTCT ATTGTTTTATTTTTCACTTTCAAGGT -3′，经RT-PCR 扩增星豹蛛CYP3313A3序列，PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃1 min，30 个循环，72℃ 5 min，反应体系为 25 μL。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化后连接到 pGM-Simple-T 载体，转化到 DH5α 感受态细胞中，涂布含有Amp 抗性的LB 平板培养基后37 ℃过夜培养，次日蓝白斑筛选单克隆菌，菌液PCR 验证后50%甘油冻存送至上海生工测序。

1.5 CYP3313A3 基因及其编码产物的生物信息学分析

使用DNAMAN9.0 软件进行序列拼接，用NCBI ORF finder（https：//www. ncbi. nlm. nih.gov/orffinder/）查找并翻译基因开放阅读框。使用Genedoc 进行多序列对比；利用ExPasy-Prot-Param tool（https：//web. expasy. org/protparam/）分析蛋白基本理化性质；使用SingalP3.0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP-3.0/）软件分析蛋白信号肽和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）工具预测蛋白跨膜区；利用Cell-Ploc2.0 软件进行亚细胞定位预测；使用SOPMA （https：//npsa - prabi. ibcp. fr/cgibin/npsa_automat. pl？ page=npsa_sopma. html）软 件预 测 蛋 白 二 级 结 构 ；用 SWISS（https：//www.swissmodel.expasy.org/）软件预测蛋白三级结构；使用 MEGA 7（NJ 法，bootstrap=1 000）软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 CYP3313A3 基因克隆

提取的星豹蛛总RNA 经超微量核酸蛋白检测仪（Scandrop 200，德国）检测，质量浓度为800 ng·μL-1，OD260/280 值 1.93，可以用于下一步试验。以星豹蛛cDNA 为模板，通过设计引物，RTPCR 扩增和 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，CYP3313A3的扩增产物条带大小在900 bp 左右（图1），测序结果显示CYP3313A3全长为906 bp，编码301 个氨基酸（图2），利用Blastp 工具搜索和同源性比较发现该基因与其它物种CYP3A 有相似之处（图3），该家族中的序列保守性相对较低，具有3 个绝对保守的残基，但它们的总体形貌和结构折叠高度保守。具有保守的一个“曲折”的螺旋，一个四螺旋 束，J 和 K 螺旋 以及 2 组 β 折 叠组成。它们构成了血红素结合环（具有绝对保守的半胱氨酸，可作为血红素铁的第5 个配体），螺旋K中的质子转移槽和绝对保守的EXXR 基序。将该基因提交至CYP450 国际命名委员会，命名为CYP3313A3，属于 CYP3 家族。

图1 CYP3313A3 基因扩增结果Fig.1 Amplification result of CYP3313A3

图2 CYP3313A3 基因和氨基酸序列Fig.2 Genes and amino acids sequences of CYP3313A3

2.2 CYP3313A3 编码的蛋白理化性质分析

利用ProtParam 软件预测分析结果显示CYP3313A3编码301 个氨基酸，预计其在哺乳动物的网状红细胞中和酵母中的半衰期分别为30 h和20 h，在大肠杆菌体内的半衰期大于10 h；不稳定系数计算结果47.63，归类为不稳定蛋白，脂肪系数为91.36，总平均亲水系数为-0.238，说明其亲水性较差，脂溶性良好，属于脂溶性蛋白。编码的总氨基酸序列中，Leu（异亮氨酸）占比最高为12%，Glu（谷氨酸）其次为7.6%，Trp（色氨酸）含量最低为0.7%。其他理化性质见表1。

2.3 CYP3313A3 跨膜预测、信号肽和亚细胞定位分析

使用TMHMM 工具进行跨膜预测分析，结果显示CYP3313A3编码产物不存在跨膜结构；使用SignalP3.0 软件预测CYP3313A3编码产物的信号肽，结果显示原始剪切位点分值C-score 最高和综合剪切点Y-score 均在第24 氨基酸位置，信号肽位置分值S-score 最大在第11 氨基酸位置，为0.836，推断该蛋白存在信号肽（图4）。利用cell-Ploc2.0 进行亚细胞定位结果显示被定位在细胞内质网上。

2.4 CYP3313A3 编码的蛋白二级结构预测分析

利用SOPMA 工具预测CYP3313A3编码的蛋白二级结构（图5），结果显示CYP3313A3编码的蛋白二级结构中，α 螺旋占比最多为45.18%，无规则卷曲为 37.21%，β 折叠为 14.29%，β 转角占比最少为3.32%。

表1 CYP3313A3 编码产物的基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of amino acids encoded by CYP3313A3

2.5 CYP3313A3 编码的蛋白三级结构预测

采用SWISS 工具进行在线预测CYP3313A3编码产物的三级结构（图6）。以CYP450 3A-Ritonavir 复合物的 X 射线晶体结构为模板（No：5Veu 3.A），在28～290 位置建模，结果显示序列同源性为37%，模型覆盖率为83%。

图3 星豹蛛CYP3313A3 与蛛形纲其他物种氨基酸序列的同源比较Fig.3 Homologous comparison of Pardosa astrigera CYP3313A3 and other species sequences of Arachnida

图4 CYP3313A3 编码产物信号肽预测Fig.4 Signal peptide prediction of CYP3313A3

2.6 系统发育分析

图5 CYP3313A3 编码产物二级结构预测Fig.5 Secondary structure prediction of CYP3313A3

图6 CYP3313A3 的三级结构预测Fig.6 Tertiary structure prediction of CYP3313A3

利用NCBI 网站中在线 Blastp 在数据库中寻找与星豹蛛CYP3313A3同源蛋白的氨基酸序列，选 取大腹园蛛（Araneus ventricosus）、隆头蛛（Stegodyphus mimosarum）、墨西哥雕像木蝎（Centruroides sculpturatus）、纤恙螨（Leptotrombidiumdeliense）、温室拟肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum）、西方静走螨（Galendromus occidentalis）、金丝蛛（Trichonephila clavipes）、斑络新妇（Nephila clavipes）、肩突硬蜱（Ixodes scapularis）、狄斯瓦螨（Varroa jacobsoni）、非洲染色大绒螨（Dinothrombium tinctorium）等同源关系较近的物种，并使用MEGA 7 软件进行聚类分析，结果显示（图7）星豹蛛CYP3313A3蛋白序列与隆头蛛、大腹园蛛的亲缘关系较近。

3 讨论

细胞色素P450 是一个非常庞大的超基因家族，是昆虫等节肢动物氧化代谢的关键体系，也是代谢抗性中的第1 道屏障，其存在广谱的底物，对杀虫剂等外源物质代谢发挥重要作用［11，12］，本研究从星豹蛛中克隆获得了一条包含完整开放阅读框的细胞色素P450 基因，利用生物信息学工具对CYP3313A3序列进行了理化性质、信号肽、跨膜预测、亚细胞定位、蛋白二级结构和三级结构预测，并对序列进行多种对比和系统发育聚类分析。显示无跨膜区，存在信号肽，推测星豹蛛CYP3313A3参与编码的蛋白主要在细胞内进行活动，为非分泌型蛋白，亚细胞定位在内质网上，主要负责内源物底物结合和外源物质的氧化还原过程。与蛛形纲其他物种多序列对比发现该基因编码的氨基酸序列存在细胞色素P450 典型的“EXXR”（X 表示任意密码子）保守特征基序，该基序位于血红素近侧，是细胞色素P450 螺旋K 区完全保守的序列，残基E 和R 在所有的细胞色素P450 中更加保守，参与稳定核心结构的作用［13］，螺旋 I 区“A/GGXD/ETT/S”在CYP3313A3氨基酸序列中则高度保守为“AGYETTS”，该特征基序在不同物种中存在较大差异，如在昆虫飞蝗细胞色素 P450 中螺旋 I 区则表现为“AGFETS”［14］；Meander 区（“PXXFXPXXF”） 和 血 红 素 区（“FXXGXXXCXG”）序列分别为“PDVFDPDRF”和“FGIGPRNCLG”。推导的氨基酸序列二级结构和三级结构表明α 螺旋和无规则卷曲是CYP3313A3蛋白肽链中的主要结构元件，且分散分布在整个肽链中，虽然细胞色素P450 基因在不同种间存在很大的序列差异性，但三维结构与同家族P450 有较大匹配度。CYP3313A3氨基酸序列与其他蛛形纲物种的系统进化分析表明，该基因编码的氨基酸序列可以单独聚类，说明根据细胞色素P450 基因也可以作为蜘蛛进化分析的一种标志基因。此外在NCBI Blastp 搜索中并没有发现与本基因编码蛋白亲缘关系较近的昆虫物种，说明星豹蛛作为捕食者，虽与昆虫同处于节肢动物门分类中，但在细胞色素P450 基因上存在较远的亲缘关系，这也可能是蜘蛛抗药性与昆虫相比存在很大差异性的原因之一。

4 结论

本文以捕食性天敌蜘蛛星豹蛛为研究对象，通过克隆星豹蛛CYP3313A3基因，并对其序列进行了生物信息学分析，研究结果对星豹蛛代谢外源次生物质提供了参考，也为后续深入研究该基因或细胞色素P450 酶类在星豹蛛体内高级结构和生理功能提供了研究基础。