一种血清替代物对MDCK细胞培养特性的研究

王美皓，王家敏，刘文凯，佛生福，靳冬武，马玉梅，马忠仁，乔自林，丁功涛

(1.西北民族大学生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；4.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃 兰州 730010；5.西北民族大学生物医学研究中心 中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030)

犬肾细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells,MDCK细胞)是由Madin和Darby于1958年从一只母曲架犬肾脏组织分离培养建立[1].由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，是公认的适于流感疫苗生产的细胞系[2-5].血清具有终止胰蛋白酶消化，提供细胞生长所需的贴壁因子、免疫球蛋白、胰岛素等其他营养物质.在动物血清中牛血清又是最常用、最合适、最有效的培养基成分.在培养基中加入适量的牛血清，不仅可以有效促进细胞的生长繁殖，还能够缩短细胞的生长周期，从而加快疫苗的生产，提高疫苗的产量，为疫苗生产企业带来更多的利益[6].目前市场上血清种类繁多，质量参差不齐，因此开发相关血清替代物代替血清进行细胞培养生产疫苗产品具有十分重要的现实意义[7].本试验以进口胎牛血清为对照，探究3个储存温区37 ℃、4 ℃、-20 ℃下血清替代物(Billion cell)支持MDCK细胞体外培养的特性与效果，评估Billion cell培养效果.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 贴壁培养型MDCK细胞从ATCC引进，引进后由甘肃省动物细胞技术创新中心按《中国药典》2010版的要求建立主细胞库(MDCK-M-60，P60)和工作细胞库(MDCK-W-63，P63).

1.1.2 培养基 DEME(high-glucous)购自兰州百灵生物技术有限公司，批号20190318.

1.1.3 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)购自Hyclone(SV30087.02，NVM0344)，使用时按10%(V/V)添加到培养基中.

血清替代物(Billion cell)：由兰州百灵生物技术有限公司开发配制，使用时按10%(V/V)添加到培养基中.使用前储存至三个温区分别为37 ℃、4 ℃、-20 ℃，验证其储存条件.

1.1.4 主要试剂及仪器 0.25%胰蛋白酶(兰州百灵生物技术有限公司)、0.2%台盼蓝(Sigma)、结晶紫染液(Sigma)、T75细胞培养瓶(Corning)、60mm细胞培养皿(Corning)、生物微倒置显微镜(Olympus，CKX-41)、CO2培养箱(ThermoFisher，3111型)、细胞计数仪(Countstar，IC1000)等.

1.2 方法

1.2.1 静置培养MDCK细胞传代稳定性观察

用含有10% FBS的DMEM完全培养基复苏MDCK工作库细胞，待细胞生长至致密单层时，分别用含有10%的37 ℃、4 ℃、-20 ℃三个储存温区Billion cell及10%FBS的DMEM培养基培养并连续传代6代，每代细胞培养至48 h时，按照1∶4比例传代，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养.每代细胞在24 h、48 h、72 h拍照观察细胞形态、长势、致密程度.

1.2.2 静置培养MDCK细胞克隆形成率分析

克隆形成率是指贴壁细胞在低细胞密度下的集落形成，也就是克隆效率，是判断细胞增殖能力的重要指标之一.取第6代生长状态良好且铺满单层的MDCK细胞，消化，制成细胞悬液，按照100个细胞/皿的细胞量接种细胞培养皿，并做平行3皿.将细胞培养皿置5%CO2、37 ℃培养箱中培养8 d，出现集落后，用吸管吸去培养液，用PBS清洗，无水甲醇固定，结晶紫染色.观察并对细胞集落计数，计算平均值.

克隆形成率(%)=(所形成集落数/接种细胞数)×100%.

1.2.3 MDCK细胞生长曲线及生长动力学分析

取第6代生长状态良好且铺满单层的MDCK细胞，分别用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%台盼蓝染色计数，按有限稀释法将混合均匀的MDCK贴壁细胞悬液稀释至1×104/mL，接种于24孔细胞培养板，每孔接1 mL细胞悬液.将24孔细胞培养板放置5%CO2、37 ℃培养箱中进行培养，每24 h消化3孔计数，计算平均值，绘制细胞生长曲线,并比较培养MDCK细胞的平均最大増殖密度、平均倍增时间[8]、平均比生长速率[9].

倍增时间=T/A，A=log2(Y/X)

X为初始接种细胞数，Y为细胞最大増殖密度前一天的细胞数，T为培养时间.

比生长速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X为活细胞密度，t为培养时间，n和n-1为2个取样计数时间点.

使用Graphpad prism 8软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，以P<0.05为差异，有统计学意义.

2 结果

2.1 静置培养MDCK细胞传代稳定性观察

分别用含有10% FBS的DMEM培养基复苏MDCK工作库细胞，细胞生长良好(见图1)，传代2代后转为分别含10% Billion cell(3个储存温区37℃、4℃、-20℃)和10%FBS的DMEM培养液培养，连续传代培养6代，-20℃储存温区的Billion cell和FBS均能较好促进细胞的生长增殖，细胞形态呈扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列.4℃储存温区的Billion cell次之，37℃储存温区的Billion cell最差.4组血清及血清替代物分别培养MDCK细胞至第3代、第6代效果见表1.

图1 MDCK细胞复苏状态(A:48h,40×；B:72h,40×)

表1 4组血清及血清替代物培养MDCK细胞效果比较(100×)

2.2 静置培养MDCK细胞克隆率分析

4组血清及血清替代物培养MDCK细胞均形成了有效的集落数，平均集落形成率从高到低依次为-20℃ Billion cell、FBS、4℃ Billion cell、37℃ Billion cell组，分别为54.0±4.0%、46.5±5.5%、41.0±2.0%、32.0±3.0%.集落的形成效果见图2，克隆形成率比较分析结果见图3.

图2 4组血清及血清替代物培养MDCK细胞形成集落

图3 4组血清及血清替代物培养MDCK细胞克隆率

2.3 MDCK细胞生长曲线及生长动力学分析

4组血清及血清替代物培养MDCK细胞生长曲线分析如图4，平均比生长速率分析见图5，平均最大增殖密度和平均倍增时间比较分析见图6、图7.4组血清及血清替代物均能实现MDCK细胞的培养，细胞生长曲线均呈“S”型，但FBS和-20 ℃、4 ℃储存温区的Billion cell能较好促进MDCK细胞的生长增殖，平均集落形成率从高到低依次为-20 ℃ Billion cell、FBS、4 ℃ Billion cell、37 ℃ Billion cell；生长动力学分析发现平均比生长速率、平均倍增时间和最大增殖浓度从高到低依次均为-20 ℃ Billion cell、FBS、4 ℃ Billion cell、37 ℃ Billion cell.

图4 4组血清及血清替代物培养MDCK细胞生长曲线

图5 4组血清及血清替代物培养MDCK细胞平均比生长速率

图6 4组血清及血清替代物培养MDCK细胞平均倍增时间

图7 4组血清及血清替代物培养MDCK细胞平均最大增殖密度

3 讨论与结论

MDCK细胞目前广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、禽流感病毒等[1-2].目前，国内外已批准利用MDCK细胞生产的疫苗有人用狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等[3].我国目前还没有自主研发的细胞基质生产的流感疫苗上市，但已经有多家企业正在利用MDCK细胞进行流感疫苗的研发[10-12].

在培养贴壁型MDCK细胞时，血清是最常用、最合适、最有效的培养基成分.血清选择不当，不仅会导致细胞生长缓慢，连续传代培养过程中细胞生长不稳定，而且血清价格昂贵，大规模生产时成本特别高.血清的选择直接关系到研发进度和疫苗企业的生产效益.本研究针对以上问题，以进口胎牛血清为对照，探究3个储存温区37 ℃、4 ℃、-20 ℃下血清替代物(Billion cell)支持MDCK细胞体外培养的特性与效果，评估Billion cell培养效果.结果显示，MDCK细胞在-20 ℃、4 ℃储存温区的Billion cell中能较好的增殖培养，-20 ℃储存温区的Billion cell培养效果优于FBS，细胞生长动力学较稳定.Billion cell血清替代物在-20 ℃储存条件下可以代替FBS用于动物细胞培养.