王 昱
(陇南师范高等专科学校 农林技术学院陇南特色农业生物资源研究开发中心, 甘肃 成县 742500)
太岁是肉灵芝,生长于地下,介于原生物与真菌之间的大型粘菌复合体,结构不是由单一的细菌构成,而是由细菌、粘菌、真菌三类物质构成的聚合体,十分稀有,是百药中的上品.太岁中主要的有效成分是吡咯喹啉醌、氨基酸、维生素、微量元素[1],具有补中益气、消除疲劳及延缓衰老等药理作用[2].熊川等[3]采用白肉灵芝水提物影响体外培养的PC-12细胞,发现能有效促进PC-12 细胞分化,对神经元有很好的保护作用.本课题前期研究表明,肉灵芝水提物能增加胶原蛋白含量、抑制皮肤细胞DNA损伤、调节皮肤衰老相关基因的表达[4].为了进一步验证TSAE的药理作用,本研究构建了衰老大鼠模型,利用生物显微技术、酶联免疫吸附、定量PCR及Western blot等技术研究太岁水提物抗衰老作用及机制.
太岁为本实验室培养,35 ℃烘干子实体,提取DNA.选用真菌通用引物ITS1和ITS4对子实体DNA进行扩增,电泳检测后条带纯化,纯化样品送至上海生物工程有限公司进行测序.鉴定结果表明,该样本为太岁(白肉灵芝).根据文献[3],取太岁子实体干品粉碎机粉碎,60目过筛,96 ℃水浴提取6 h、离心、收集上清液、过滤.滤液冻干,得到太岁水提物.
健康SD大鼠50只(许可证号:SCXK(甘)2005-0007),体质量200~250 g,雌雄各半).同条件饲养一周后随机分为5组:对照组、模型组、TSAE低剂量组、TSAE中剂量组和TSAE高剂量组,每组10只.模型组和TSAE组大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖(北京优尼康生物科技,批号MG05201)溶液300 mg/kg·bw[5],同时TSAE低、中、高剂量组分别灌胃(50、100 和200 mg /kg·bw)的TSAE[6],对照组每天注射等量的0.9% 生理盐水,连续处理7周.
采用颈椎脱臼法处死大鼠,用 8%硫化钠溶液脱毛后立即取大鼠背部正中皮肤(0.5 cm × 0.5 cm 大小)2 块,去掉皮下脂肪及结缔组织,投入4%多聚甲醛液固定24 h.常规石蜡包埋切片(6 μm),H.E染色,在光学显微镜(Olympus,FX-35WA,Japan)下观察并拍照.
取背部皮肤的真皮,按照ELISA检测试剂盒(ELx800,美国BioTek公司)说明书操作,检测各组大鼠皮肤组织中透明质酸(hyaluronic acid,Ha)的质量浓度.
取大鼠背部皮肤的表皮进行RIPA裂解,提取总蛋白,BCA法测定总蛋白浓度.样品经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜,5%脱脂奶粉封闭.一抗单克隆兔抗鼠透明质酸结合蛋白1(hyaluronan binding prolcint HABP1)、角蛋白K19(浓度均为1︰1000)在室温下孵育2 h,4 ℃过夜.充分洗涤,加偶联辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(浓度为1︰5000)孵育,洗膜后加ECL显影,以β-actin作为内参照,运用Image Lab 软件进行曝光成像,采用Quantity one 软件分析条带灰度值,实验重复3次.
取大鼠皮肤,放入2 mL 的离心管,加入1 mL Trizol后用匀浆器反复研磨,离心(14 000 rpm)10 min.取上清液通过酚-氯仿抽提RNA.以总RNA为模板逆转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测(RNA抽提试剂盒、反转录试剂、定量PCR试剂Taka Ra公司),并采用 ABI 7500 软件分析,用2-△△Ct方法进行相对定量.其中K19引物序列上游-CAGATAAGCAAGACCGAAG,下游-CAGCTGGACTCCATAACG;HABP1引物序列上游-TTGTCTCCATCTGGGTTTCTG,下游-CTACGTTGACGACGGCTACTC;β-actin引物序列上游-GAGGGAAATCGTGCGTGAC,下游-CTGGAAGGTGGACAGTGAG.引物由上海涵悦生物科技有限公司设计,上海生工生物技术有限公司合成.
对照组大鼠皮肤组织结构正常,没有明显的病理损害特征.模型组大鼠表皮变薄,结构不完整,皮肤附属器减少;真皮和皮下结缔组织被致密、无弹性的纤维化组织所替代,皮肤纤维化严重.TSAE高剂量组大鼠皮肤组织形态接近对照组,表皮较厚,组织结构完整,皮肤附属器较多,见图1.
A.对照组; B.模型组; C.TSAE高剂量组(标尺示50 μm)
与对照组相比,模型组大鼠皮肤组织HA质量浓度显著下降(P< 0.01).与模型组相比,TSAE低、中、高剂量组大鼠皮肤组织HA质量浓度明显升高(P< 0.05,P< 0.01),见图2.
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05);肩标不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01);肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P > 0.05),下同.
以β-actin 的吸光度值作为内参照,对各组条带的吸光度值校正后进行半定量分析.与对照组相比,模型组大鼠皮肤HABP1、表皮K19蛋白含量极显著降低(P< 0.01).经TSAE干预后,TSAE低、中、高剂量组大鼠皮肤HABP1、表皮K19蛋白含量呈明显升高趋势(P< 0.05,P< 0.01).以上结果与PCR检测HABP1、表皮K19 mRNA结果一致(图3,图4).
注:1.对照组; 2.模型组; 3.TSAE低剂量组;4.TSAE中剂量组;5.TSAE高剂量组
图4 各组大鼠皮肤HABP1、K19 mRNA表达
人体衰老是一个多因素、多系统的不可逆过程,常伴随着组织、器官功能的退行性变化.皮肤的衰老是机体整体老化的一部分,是机体内各种生化反应的综合过程[7].基于传统中药理论,采用现代科学技术手段提取天然产物有效成分,开发用于美容治疗及皮肤健康保健的功能性食品是当前重要课题之一.本实验衰老大鼠模型,从皮肤形态学上的改变来观察太岁水提物的作用.模型组大鼠皮肤组织结构出现了明显的病理改变,表皮变薄,表皮、真皮及皮下组织层次不明显.采用TSAE作用后,大鼠皮肤结构完整,表皮增厚,真皮内胶原纤维增多,排列比较紧密、整齐.这表明TSAE对衰老大鼠皮肤组织的损伤有明显的保护作用.
HA是生物体内一种天然高分子多糖,为皮肤细胞外基质的重要成分,也是一种重要的结构支撑和保湿物质,可根据周围组织的含水量改变自身的吸水量,进而调节皮肤水分平衡和维持细胞结构[8].保持皮肤的韧性和弹性,HA也能够清除生物体内自由基,延缓皮肤衰老[9].HABP1具有独特的晶体结构,属于透明质酸黏素家族中的一员,能够与HA高度特异性结合,与透明质酸的含量呈正相关系[10].在哺乳动物细胞内外均有表达,与多种细胞蛋白发生作用,具有细胞间黏附、细胞信号转导、细胞凋亡、精子成熟和运动等多种功能[11].本实验结果显示,模型大鼠皮肤组织HA质量浓度、HABP1表达均显著下降,说明HA含量减少可能是导致大鼠皮肤组织病理改变的重要原因.而经TSAE作用后,皮肤组织HA质量浓度、HABP1表达显著升高,说明TSAE对衰老大鼠皮肤组织HA质量浓度及HABP1表达有促进作用,而HA含量的增加明显改善了衰老的皮肤组织.
角蛋白是一类典型中间丝家族成员,是上皮细胞骨架的重要组成部分,在不同的上皮类型或者不同的细胞分化状态中,具有分子多样性的特点[12].表皮干细胞是皮肤特异的干细胞,主要位于表皮基底层,具有很强的分裂增殖能力,对于保持皮肤正常结构、内环境稳定、自我更新及自我修复具有重要意义[13,14].K19是表皮干细胞表明特异性的标记物,在正常皮肤组织基底层中呈阳性表达,而且其表达量与表皮干细胞的数量呈正向关系.婴儿皮肤K19的表达量要显著高于成年人[15-18],表明角蛋白在皮肤衰老中发挥着重要作用.本实验用PCR和Western blot研究结果表明,模型大鼠皮肤表皮K19表达显著下降,说明衰老表皮上皮干细胞的增殖更新能力受到明显的抑制.而经TSAE作用后,皮肤表皮K19表达显著升高,说明TSAE对衰老大鼠表皮中K19 的表达有促进作用,这可能通过促进表皮干细胞的增殖延缓皮肤衰老速度.
综上所述,TSAE能够改善衰老大鼠皮肤组织的形态学结构,这种作用可能与干预HA的含量和表皮角蛋白K19的表达有关.但对于太岁中有效生物成分的药用价值,目前无合理的科学解释,还需大量的药理实验验证.