基于TRPV1通道探究正天丸治疗偏头痛的作用机制

白方会，张保朝，徐茜，贾东佩，胡科，陈宝田，李慧

(1. 河南省南阳市中心医院，河南 南阳 473000；2. 南阳师范学院，河南 南阳 473000；3. 南方医科大学，广东 广州 510515；4. 广东省广州市红十字会医院，广东 广州 510220)

原发性头痛中以偏头痛最常见，呈反复发作性，以半侧或双侧头部跳痛为特点，恶心呕吐是其常见伴随症状，劳累和声、光刺激是其主要诱发或加重因素[1]。最新调查表明，偏头痛是人类第6个易患疾病，其致残率为全球第2位[2]，由此可知，偏头痛是威胁人类健康的最大的功能性疾病。我国偏头痛年患病率为9.3%，其中女性患病率是男性的3倍[3]。C1-C2颈髓背侧核至三叉神经脊束核尾部(trigeminal nucleus caudalis，TNC)统称为三叉神经颈髓复合体(trigeminal nerve cervical spinal complex，TCC)[4]，是三叉神经二级神经元，是偏头痛发生时信号传递的重要部位。三叉神经脊束核尾部有TRPV1通道存在，TRPV1受体的活化在偏头痛发生与痛觉过敏形成中均起重要作用[5-7]。正天丸临床应用30余年，有较好疗效与较高安全性，但其作用机制尚未明确。本研究通过检测偏头痛大鼠TCC内TRPV1受体的水平，以探讨正天丸的作用靶点。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠24只，平均周龄(10.1±1.3)周；平均体质量 (270±30) g。由南方医科大学实验动物中心提供，饲养条件：室温23℃～26℃，光暗周期12 h，相对湿度40%～60%，自由进食水，待大鼠适应7 d后干预。实验遵从《关于善待实验动物的指导性意见》的规定[8]。

1.2 实验药物与试剂 正天丸(华润三九，批号：1308002H)、硝酸甘油注射液(益民药业，批号：131122)、荧光二抗-Cy3(凯基生物)、VR1兔多克隆抗体(Santa Cruz)、β-actin(中杉金桥)、PVDF膜(Millipore)、ECL发光液和BCA试剂盒(碧云天)、IS 2000 MM图像工作站(Kodak)。

1.3 偏头痛模型的建立 随机将24只大鼠分为空白组、偏头痛组、正天丸组，每组8只。正天丸组每天灌胃一次正天丸(1.62 g/kg)；其余两组灌胃1 ml 0.9% NaCl，连续给药7 d，末次给药30 min后空白组皮下注射0.9% NaCl溶液0.5 ml，其余两组大鼠颈背部皮下注射硝酸甘油(10 mg/kg)，制造偏头痛模型[9]。

1.4 行为学观察 当大鼠出现频繁用前肢挠头、耳朵发红、转圈、爬笼等不安表现提示造模成功[5]。根据前期研究结果，观察造模后3 h内行为学表现。以每30 min作为一个观察时间段，头痛开始以30 min内连续挠头5次以上为标志，头痛消失以 30 min内挠头次数低于5次为标志。

1.5 标本采集与指标检测

1.5.1 Western blotting 造模4 h后，大鼠麻醉后迅速冰上取材，裂解组织，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭1 h，TBST冲洗3次，加入一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜，羊抗兔二抗(1∶3000)室温孵育1 h，采用ECL化学发光法进行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0(Kodak)软件分析条带灰度值，每组重复检测3次，以β-actin为内参。

1.5.2 免疫荧光 造模4 h后灌注固定，开颅取出全脑连至颈2以下颈髓，继续固定24 h，脱水、石蜡切片，片厚约10 μm。切片顺次脱蜡、水化、热抗原修复和灭活内源性过氧化物酶后， BSA封闭后加入TRPV1一抗(1∶500)，4℃过夜，滴加Cy3荧光二抗(1∶500)，避光孵育1 h，倒置显微镜下观察结果，显现红色为TRPV1表达阳性，空白组以PBS作一抗。

1.5.3 实时荧光定量PCR 麻醉后冰上快速分离大鼠TCC，-80℃保存。TRPV1总RNA的提取和cDNA的转录均按照相应试剂盒说明书进行操作，25℃ 反应10 min→37℃反应1 h→95℃反应5 min。以GAPDH为内参照，由上海英骏生物技术有限公司进行引物合成，建立20 μl的PCR反应体系：其中dH2O 7 μl，各1 μl上下游引物，1 μl cDNA，10 μl的Taq酶。PCR反应条件：95℃ 10 s，95℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃10 s，共45个循环。PCR仪读取TRPV1与GAPDH的循环阈值，根据相对定量法(2-△△CT)计算各样本TRPV1mRNA的△CT值：△CT=目的基因CT-内参基因CT。

2 结果

2.1 行为学表现 自造模后10 min起，偏头痛组和正天丸组大鼠纷纷出现不断爬笼、转圈等行为，耳朵开始发红，频繁快速挠头，标志造模成功。偏头痛组和正天丸组挠头表现在造模后1 h内最明显，正天丸组大鼠大约造模1.5 h以后未再出现连续挠头5次以上表现，耳红消失，蜷卧不动；偏头痛组大鼠造模2.5 h以后未再出现连续挠头5次以上表现，耳红消失，活动明显减少，倦怠不动。空白组大鼠仅皮下注射0.9% NaCl溶液，30 min内有间断挠头表现，随后挠头不明显，一直未见耳朵发红。

2.2 正天丸对TCC中TRPV1受体表达的影响

2.2.1 免疫荧光结果 免疫荧光结果表明，TRPV1在每组大鼠TCC内均可见阳性表达(图中箭头所示红色高亮部分)。从图1可见，偏头痛组大鼠TCC内可见TRPV1明显高表达，正天丸组表达强度低于偏头痛组，空白组也可见TRPV1轻度阳性表达(见图1)。

图1 各组大鼠TCC中TRPV1的表达(×100)注：A：空白组，B：偏头痛组，C：正天丸组。

2.2.2 Western blotting结果 结果显示TRPV1/β-actin的比值分别为：空白组(0.35±0.04)，偏头痛组(0.86±0.01)，正天丸组(0.70±0.03)。偏头痛组TRPV1蛋白表达较空白组显著增高(t=37.51，P<0.001)；与偏头痛组相比，正天丸组TRPV1蛋白表达显著降低(t=-13.907，P<0.05)，见图2。

图2 三叉神经颈髓复合体中TRPV1蛋白的表达注：##与偏头痛组比，P<0.001。

2.2.3 PCR结果 以GAPDH为内参将TRPV1的灰度值进行标化，结果如下：空白组(0.995±0.010)、偏头痛组(2.57±0.37)、正天丸组(1.71±0.25)。偏头痛组TRPV1 mRNA表达较空白组明显增加(t=-4.009，P=0.005)，正天丸组TRPV1 mRNA表达较偏头痛组明显降低(F=37.149，P<0.001)，见图3。

图3 三叉神经颈髓复合体TRPV1受体mRNA的表达注：#与偏头痛组比，P<0.001

3 讨论

在中医古籍中偏头痛又名“边头风”“偏头风”。自《黄帝内经》以来，历代医书均有对偏头痛理法方药的记载，偏头痛多为本虚标实之证，病位在脑髓经络，与肝、脾、肾三脏关系密切[10-11]。多风、多瘀、多湿、多虚是多年来陈宝田教授对偏头痛患者病理机制特点的总结。陈教授吸取川芎茶调散、麻黄附子细辛汤、桃红四物汤、四藤消震饮四方之精华，于1985年创制正天丸。川芎性味辛温，功善祛风止痛、活血行气，为该方之君药，自古有“头痛需用川芎”之说法。正天丸综合各方之长，具有疏风通络、活血止痛、养血平肝之功，30余年来以其卓著的疗效得到广大患者及医生的好评，并远销海外。临床随机对照试验(RCT)研究表明，正天丸能有效减轻患者的头痛强度，减少发作次数，并缩短头痛持续时间，临床疗效确切，且无明显不良反应[12]。但其具体作用机制尚未明确。

TCC是偏头痛发作时伤害性信息由颅外向颅内传导的重要二级神经元，偏头痛患者常伴的恶心呕吐表现也是由TCC发出信号刺激延髓呕吐中枢所致[13]。TRPV1受体又称香草酸受体亚型1(VR1)或辣椒素受体，是TRP亚家族中首个用于偏头痛研究的成员。研究显示背根神经节、三叉神经节、三叉神经背束核尾部(TNC)、硬脑膜、蓝斑和下丘脑均有TRPV1通道存在，在偏头痛和其它神经病理性疼痛的发病机制中起特定作用[5，14-15]。缓激肽、前列腺素、低pH值、辣椒素、炎性分泌物等炎性因子可以兴奋TRPV1，使局部脑膜CGRP释放增加，脑膜血管扩张、血流加速，TCC兴奋性增加，从而介导偏头痛的发作[16-17]。小鼠敲除TRPV1受体后，伤害性信息的传递明显减少，疼痛反应出现的时间明显推后[18]。

我们的结果显示：生理状态下大鼠TCC神经元既有TRPV1受体较低水平的表达，免疫荧光结果可以直观地显示偏头痛组大鼠TRPV1受体表达亮度较空白组明显增高。Western blotting和RT-PCR结果显示偏头痛组大鼠TCC内TRPV1受体蛋白和基因表达水平均较正常组大鼠显著增高，印证了TRPV1受体的活化参与了偏头痛发作过程中的痛觉信息传递。正天丸组行为学表现持续时间较偏头痛组明显缩短，证实了正天丸的有效性，其TRPV1受体蛋白和基因表达较偏头痛组明显降低，表明正天丸可以抑制TRPV1受体的过表达从而抑制疼痛信号在TCC中的传递起到治疗偏头痛的作用。