小鼠胚胎成纤维细胞饲养层、Matrigel及贴附因子包被培养板培养小鼠胚胎干细胞的对比研究

赵 芳，陈坤琳，邢光东，钱 勇，曹少先，李隐侠，孟春花，张建丽，张 俊，桂红兵，仲跻峰，王慧利

（江苏省农业科学院 畜牧研究所，南京 210014）

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是从哺乳动物囊胚内细胞团（inner cell mass，ICM）中分离出来的多能性细胞，具有无限增殖、自我更新和分化成所有主要细胞系的能力［1］。在体内，多能性是胚胎发育过程中出现的一种短暂状态；但在体外需要在培养器皿的底部铺上特殊的培养基质才能使ESCs黏附和增殖。在细胞培养基质的基础上通过补充外源性关键因子可以诱导ESCs无限期维持自我更新状态及多能性，进而开展胚胎发生、组织分化、药物筛选、疾病建模、移植治疗及转基因动物工程等科学研究［2-4］。因此，细胞外基质在ESCs培养及研发应用中意义重大。

目前，人和小鼠ESCs的培养常用饲养层细胞，如小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）或无饲养层的细胞外基质，如基质胶（Matrigel），作为细胞外基质，家畜ESCs的培养体系主要借鉴了人和啮齿动物ESCs的研究方法。MEFs饲养层的制备需经过丝裂霉素C或γ射线照射处理，而Matrigel是从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的，主要由层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、硫酸肝素蛋白多糖、巢蛋白和生长因子组成。MEFs饲养层和Matrigel在制备过程中均表现出批次间的可变性［5］。在培养人或家畜ESCs时，由于MEFs和Matrigel存在异质性及批次不稳定性问题，易引发ESCs分化或癌化［6］。因此，明确培养条件、优化细胞外基质有助于更精确地探索ESCs自我更新和分化的分子基础。本试验设置了MEFs、Matrigel和 贴附因子（attachment factor，AF）3种细胞培养板，通过分析小鼠ESCs（mESCs）的形态变化、克隆集落形成及多能性调控因子的表达，综合评定3种不同处理对mESCs多能性维持的影响，为建立和优化家畜ESCs培养体系提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验动物

6周龄SPF级ICR雌性小鼠20只和雄性小鼠3只，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。小鼠饲养在温度20～26℃、湿度40%～70%、光照／黑暗12 h／12 h、自由饮水的标准化实验动物环境中。

1.2 试验试剂及仪器

Anti-Sox2（sc17320）、Anti-Oct4（sc5279），购自SantaCruz公司；mLIF（HY-P7084）、丝裂霉素-C（HY-13316），购自MCE公司；PD0325901（S1036）、CHIR99021（S1263），购自Selleck公司；Matrigel（354277，CORNING），购自睿捷生物公司；β-巯基乙醇（M 6250）、小鼠胚胎培养基（KSOM，MR-121-D），购自Sigma生物公司；胎牛血清（SH30396，Hyclone）、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，11965-092）、Dulbecco’s Modified Eagle Medium-F12（DMEM-F12，11330-032）、Neurobasal Medium（21103-049）、N2 Supplement（17502-048）、B-27 Supplement（12587-010）、血清替代物（A3181502）、0.05% Trypsin-EDTA（25300-062）、GlutaMAX（35050-061）、非必需氨基酸（11140-050）、Attachment Factor（AF，S006100）、青霉素-链霉素（15140-122）、Knock-Out Serum Replacement（A3181502）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），购自Thermo Fisher Scientific公司；BCIP／NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒（C3206），购自碧云天生物公司；血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、人体绒膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），购自宁波第二激素厂。

500 mL N2B27细胞培养液的配制：240 mL DMEM／F12 ＋240 mL Neurobasal＋2.5 mL N2 supplement＋5 mL B27 supplement＋1% GlutaMAX ＋1% 非必需氨基酸 ＋0.1 mmol／Lβ-巯基乙醇 ＋1% 青霉素-链霉素 ＋5% 血清替代物＋10 ng／mL mLIF＋3μmol／L CHIR99021＋1μmol／L PD0325901。

细胞培养箱（型号为Thermo ScientificTM8000），购自赛默飞公司；倒置荧光显微镜（Nikon ECLIPSE Ti），购自尼康仪器有限公司。

1.3 小鼠囊胚获得、mESC建系培养及饲养层的制备

雌鼠每只腹腔注射10 U PMSG，48 h后注射10 U hCG，与公鼠合笼；合笼第2天观察雌鼠是否有阴道栓，将见栓雌鼠记为孕0.5天；在孕1.5天，颈椎脱臼法处死合笼雌鼠；打开腹腔取出双侧输卵管放于M2操作液中，用32号无菌注射器吸取M2培养液，在体视显微镜下小心冲洗输卵管，收集2-细胞阶段胚胎，置于含有5%KSR的KSOM培养液中，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养至囊胚阶段；将囊胚接种到预先铺有MEFs饲养层的细胞培养板上，添加N2B27细胞培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养3～5 d；在解剖镜下用拉细的巴斯德吸管小心切割分离内细胞团细胞（ICM）集落进行机械传代；培养2～4 d后，出现克隆状ESCs集落，称为第1代（记为P1代），用酶消化法进行分离、传代，重新接种于新的MEFs饲养层。

将传代3代以内的原代MEFs以1×106／mL密度接种到细胞培养板上，添加适量的DMEM培养基进行培养，等细胞单层覆盖培养板时用10μg／mL丝裂霉素C处理3 h，用PBS清洗3遍，加入适量N2B27细胞培养液，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中，备用。

1.4 Matrigel和AF培养基的制备

将40 μL Matrigel加入预冷的3.5 mL DMEM-F12中，以250μL／孔加入24孔板中，于室温下孵育2 h。使用前弃去液体，添加N2B27细胞培养液，备用。

将AF以250μL／孔加入到24孔板中，于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 h，然后用PBS清洗1遍，添加N2B27细胞培养液，备用。

1.5 碱性磷酸酶染色（AP）鉴定

弃掉细胞培养液，加入PBS清洗细胞。加入4%多聚甲醛，室温固定15 min；弃掉多聚甲醛，用PBS清洗2次，每孔加入500μL BCIP／NBT染色液，室温避光染色15 min～2 h，弃掉染色液；加入PBS清洗，用纯化水终止染色，于显微镜下观察，拍照。

1.6 集落形成试验

mESCs以1 000个细胞／孔接种于24孔板，加入含5% KSR的N2B27细胞培养液培养2 d，在显微镜下观察mESCs集落形成情况并计数。

1.7 免疫荧光染色

用500μL PBS缓慢清洗细胞3次，每次5 min；加入200μL 4%多聚甲醛固定细胞，室温放置15～30 min；用PBS洗细胞3次，每次5 min；用0.5% Triton X-100通透20 min，PBS洗3次，每次5 min；用封闭液封闭细胞1 h；添加一抗（按照一抗稀释比例进行稀释），4℃避光过夜；用PBS清洗3次，每次5 min；添加二抗（按照二抗稀释比例进行稀释），室温避光孵育1 h；PBS清洗细胞3次，每次5 min；加200μL Hoechst 33342避光染色5 min，用PBS清洗细胞，在显微镜下观察，拍照。

1.8 qRT-PCR

根据NCBI核酸数据库中相应基因mRNA全序列，利用Primer premier 5.0软件设计引物。引物由擎科生物公司合成，引物序列见表1。采用TRIzol法提取肝脏样品中的总RNA，用紫外分光光度计检测RNA质量和浓度，进行反转录及荧光定量PCR扩增。被检样品均重复3次，取平均值；以GAPDH作为内参基因，利用2-△△Ct法（2-△△Ct表示处理组目的基因的表达量相对于对照组的变化倍数）计算各基因的相对表达量，△Ct ＝Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct＝（Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.9 数据的统计分析

试验数据采用SPSS软件进行统计分析，采用t检验进行比较，以P ＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 mESCs细胞形态特征

见图1。 由图1可以看出：从囊胚孵化物（图1A、B）分离的mESCs细胞排列紧密，呈集落状生长，克隆呈突起圆顶状，边缘遮光性强，与周围的饲养层细胞界限分明，为Naïve-ESCs（图1C～E）；AP染色后mESCs细胞克隆呈现红色，边缘饲养层细胞未着色作为阴性对照，说明mESCs细胞克隆AP染色阳性（图1F）。

2.2 MEFs、Matrigel及AF处理对mESCs细胞形态及集落形成的影响

用含5% KSR的N2B27培养液培养mESCs，分别比较MEFs饲养层、Matrigel及AF细胞培养板对mESCs细胞形态特征及克隆集落形成的影响，结果见图2。

由图2可以看出：MEFs饲养层能很好地维持mESCs圆顶状形态；Matrigel处理细胞培养板培养的mESCs边缘遮光性好，但形态不是规则的圆顶状；AF细胞培养板培养的mESCs中有少量mESCs形态呈扁平状，类似于Primed状态的EpiSCs；另外，AF细胞培养板培养的mESCs黏附数量少，形成的集落数量显著少于MEFs饲养层和Matrigel细胞培养板。

2.3 MEFs饲养层、Matrigel和AF处理对多能性调控因子蛋白表达的影响

利用免疫荧光检测不同处理mESCs中多能性调控因子Oct4和Sox2蛋白的表达情况，结果见图3。

由图3可以看出，3种不同处理mESCs均检测到多能性调节因子Oct4和Sox2蛋白的表达。

2.4 MEFs、Matrigel及AF处理细胞培养板对多能性调控因子mRNA表达的影响

分别收集Matrigel和AF细胞培养板培养的mESCs，用qRT-PCR检测mESCs中多能性调控因子的mRNA表达，结果见图4。

由图4可以看出：Matrigel细胞培养板培养的mESCs中Oct4 mRNA表达略高于AF，但差异不显著（P＞0.05）；而Matrigel细胞培养板培养的mESCs中Nanog和Sox2的mRNA表达水平显著或极显著高于AF（P＜0.05或P＜0.01）。

3 讨论

ESCs增殖及自我更新需要稳定的微环境，微环境改变会影响ESCs多能性维持而触发分化。细胞外基质是干细胞自我更新和增殖的重要微环境，对细胞外基质的优化有助于明确ESCs培养必需的微环境和建立稳定的ESCs培养体系。为深入研究和优化ESCs培养体系，本试验对MEFs、Matrigel和AF制作的培养基底进行了比较分析。

目前，MEFs是最常用的干细胞培养基底。MEFs饲养层的优势在于能够分泌出诱导多能干细胞未分化生长所必需的细胞因子［7］。然而，MEFs饲养层制备要求高，MEFs的代数、密度及增殖灭活方式均会影响MEFs饲养层质量，从而影响细胞因子的分泌。细胞因子表达和分泌的不一致，很难确定哪些成分是在未分化状态下支持ESCs所必需的［8］。此外，γ照射饲养层细胞不仅会阻碍其增殖，还会导致细胞凋亡，进而改变可溶性因子的分泌和细胞外基质的沉积，这些因素都可能对ESCs的自我更新和一致性培养产生负面影响［9］。因此，MEFs饲养层细胞微环境的不确定性限制了人们深入解析ESCs生物学特性的分子机制。本试验中，MEFs饲养层可以高效制备mESCs，并有效维持mESCs圆顶状的Naïve状态。然而，对于人类干细胞或家畜干细胞培养，MEFs饲养层可能分泌异种物质而引发免疫应答和分化［6］，因此，建立一种成分明确且稳定的细胞外基质有助于开展人类干细胞及家畜干细胞的研究及应用。

Matrigel是基于无饲养层理念研发出来并广泛应用于人干细胞体外培养的细胞培养基底。本试验中，Matrigel细胞培养板培养的mESCs克隆形态不是规则的Naïve圆顶状，且克隆集落生成效率慢于MEFs。目前，Matrigel成功用于人类ESCs和PSC诱导培养，但不能有效用于牛胚胎干细胞建系及传代培养［10］。此外，由于MEFs和Matrigel存在异种成分，使得这两种基底培养的干细胞难以应用于临床治疗。AF的主要成分是明胶，本试验中利用AF包被培养皿后接种mESCs，在5% KSR浓度的N2B27培养液条件下能维持mESCs的增殖和多能性，但有少量mESCs的形态接近于Primed的扁平状。

ESCs的自我更新及多能性由复杂的基因调节网络控制，其中转录因子Oct4、Sox2和Nanog发挥至关重要的作用而被作为ESCs多能性标记。Oct4在ESCs多能性维持中发挥不可或缺的作用；Oct4水平升高或降低50%，可分别分化为表达内胚层、中胚层或滋养外胚层标记的细胞［11］。Sox2通过其高度保守的HMG-box结构域与DNA结合，与其他多能性调控因子Oct4和Nanog合作，主要发挥转录抑制作用而参与ES细胞多能性及诱导分化调控［12］。Nanog是胚胎发育初期在Oct4启动表达后维持ICM多能性的又一必需基因，Nanog高表达与ESCs多能性的维持紧密相关。Nanog主要通过与靶基因调控区结合，选择性抑制分化基因表达或促进多能性基因表达，维持ESCs多能性和自我更新。Nanog与甲基化羟化酶TET1、TET2结合并调控其活性，增加Esrrb和Oct4的5-羟甲基化水平，启动它们的表达以诱导重编程及维持多能性［13］。本试验中，在含5% KSR的N2B27培养条件下，与Matrigel相比，AF细胞培养板培养的mESCs中Oct4、Sox2和Nanog的转录表达均下调。这一结果提示AF细胞培养板培养的mESCs更易于发生分化。此外，鉴于不同种属ESCs对培养体系要求不同，如Lif重组蛋白能有效维持mESCs的多能性［14］，而生长因子FGF-2在猪、牛胚胎干细胞建系及多能性维持中起重要作用［10，15］，如何使Matrigel、AF细胞培养板适用于大家畜胚胎干细胞分离及培养，还需要针对ESCs的种属特性对培养体系进行进一步探索、优化。

4 结论

Matrigel和AF作为细胞外基质培养的mESCs具有一定的多能性，传代后细胞黏附数量和集落形成数量少于MEFs基底；此外，AF基底培养的mESCs易于发生分化，因此，需要在培养体系及细胞传代密度上有所调整。