Kisspeptin／GPR54在性腺中调控动物卵泡发育的研究进展

梅 山，杜旭旭，杨朝云，史远刚，淡新刚

（宁夏大学 农学院，银川 750021）

Kisspeptin是由kiss1基因编码的肽类激素，通过G蛋白偶联受体GPR54（也称kiss1R）发挥作用。Kiss1被报道在非转移性黑色素瘤细胞中表达，随后被证明是抑制恶性黑色素瘤细胞转移潜能的抑制因子［1］。在中枢神经系统中，kisspeptin／GPR54直接或间接与神经递质相互作用，调控促性腺激素释放激素（GnRH）的释放，在动物生殖内分泌、初情期启动及季节性繁殖中扮演着重要作用。Kisspeptin／GPR54信号系统还在外周组织中表达，参与卵巢功能的调节、胚胎植入、胎盘形成、血管生成、胰岛素分泌等生物学过程。最近的诸多研究表明，kisspeptin在动物卵巢中发挥调控功能，包括卵泡发育成熟、颗粒细胞活力、类固醇合成等方面。文章阐述了kisspeptin／GPR54的生物学特性和kisspeptin／GPR54在动物卵巢中的定位分布，归纳了kisspeptin／GPR54在卵泡发育中的调控作用，突出强调了kisspeptin／GPR54在调控卵巢颗粒细胞活力及类固醇合成中的作用及其在细胞内的相关信号通路。

1 Kisspeptin／GPR54简介

编码kisspeptin蛋白的kiss1基因位于人染色体lq32～41区域，由4个外显子和3个内含子组成，前2个外显子不翻译；第3个外显子是由38个非编码碱基对构成，后接转录起始位点和其余103个编码碱基对；第4个外显子中包含332个编码碱基对、终止子和多腺苷酸化信号［1］。Kiss1编码的初始肽类产物由145个氨基酸构成，根据其水解后氨基酸链长度的不同可以分为kisspeptin 54、kisspeptin14、kisspeptin13、kisspeptin10，统 称 为kisspeptins［2］。Kisspeptins家族及其包含的各级短肽都具有相同C端结构Arg-Phe-NH2，属于RF-酰胺化修饰结构，具有类似的生物学活性。目前已经克隆出很多物种kiss1基因的cDNA序列，包括人、牛、羊、猴、小鼠、大鼠和黑猩猩。通过氨基酸序列同源性分析发现，人和其他灵长类动物的同源性高于85%，而人和啮齿类动物之间同源性为45%～50%［3］。在1999年研究者发现，在人及鼠的大脑中kisspeptin是GPR54的一个配体，kisspeptins作为其天然配体，发挥调控作用的途径就是通过激活其特异性受体GPR54来实现的［4］。人类的GPR54基因含有5个外显子和4个内含子，位 于19 号 染 色 体 上，别 名 AXOR12 或hoT7T175，其开放式阅读框架包括398个氨基酸，可编码的分子质量为75 kD，其与甘丙肽及阿片受体家族具有一定的同源性［5］。J.Roa等［6］发现，人类GPR54同哺乳动物序列同源性相似程度较高，可达80%；但人与水生动物或两栖动物相似程度偏低，仅为45%，可见GPR54在不同动物中较保守。

Kisspeptin及其受体GPR54在哺乳动物的各个组织器官中大量表达，其生物学功能最初被界定为抑制肿瘤转移，突变或无法正常表达kiss1基因可能会引发子宫内膜癌、乳腺癌、膀胱癌等多种病症，还与多种恶性肿瘤的转移和侵袭有关［7］。进一步研究发现，kisspeptin／GPR54系统是调节生殖活动中起关键作用的神经元网络之一。Kisspeptin神经元位于生殖轴的最上端，释放的kisspeptin与其受体GPR54结合，促进GnRH的分泌，影响促卵泡素和促黄体激素的释放，进而影响哺乳动物的各项繁殖性能，包括性别分化、青春期启动、促性腺激素分泌的调节以及激素和环境对生育的控制［8］。除了在下丘脑-垂体-性腺轴起重要作用外，kisspeptin还参与动物机体代谢［9］、妊娠［10］、季节性发情［11］等一系列重要生理事件的调控。研究表明，kisspeptin／GPR54系统在调节动物机体各种生理过程中扮演着重要的角色。全面了解kisspeptin／GPR54系统在生殖中的表达、功能及其潜在的分子机制将有助于生殖疾病的预防、诊断和治疗。

2 Kisspeptin／GPR54在卵巢中的定位和表达

J.M.Castellano等［12］研究发现，在大鼠发情周期的不同阶段kisspeptin及其受体GPR54的编码基因均表达，在初情期前的大鼠卵巢中kiss1mRNA水平较低，在初情期后的卵巢中kiss1mRNA水平显著升高；在成年大鼠的卵母细胞、除无动情期外所有时期的颗粒细胞和间情期黄体中kiss1mRNA持续表达，在发情前期卵巢中表达水平开始升高，之后急剧下降，发情间期仅有少量增加。而GPR54mRNA水平在大鼠整个周期中保持在较低水平，没有明显的波动。F.Gaytan等［13］在人卵巢周期中检测到了GPR54的表达，在生长卵泡中GPR54定位在生长卵泡的膜层，排卵后免疫染色定位在未完全黄素化的颗粒细胞中。在对西伯利亚仓鼠的研究中发现，kisspeptin存在于卵泡中，在卵泡膜细胞和颗粒细胞中表达量较高，在动情前期和动情间期达到高峰；GPR54在腔前卵泡、腔内卵泡及黄体中类固醇生成细胞中表达，在动情前期中的表达相对较强，而在动情间期中有所下降［14］。Z.Merhi等［15］研究发现，kisspeptin的表达与年龄相关，与幼龄小鼠相比，老年小鼠卵巢中的kiss1和GPR54mRNA水平显著升高；在人类卵丘颗粒细胞中，GPR54mRNA水平与年龄呈正相关。M.E.Cielesh等［16］发现青春期前母犬卵巢中没有kiss1表达，kiss1／GPR54在生殖周期的各个阶段均存在于卵母细胞、颗粒细胞和黄体中，卵泡发育的不同阶段不影响GPR54表达。P.Tanyapanyachon等［17］发现，kisspeptin及其受体GPR54在家猫各个时期的卵巢和子宫中均有表达，不同卵巢期间的定位分布无显著差异。其他研究发现，GPR54在乌鱼卵巢的表达从青春期中期开始显著升高，是青春期早期的2倍［18］。

以上这些研究表明kisspeptin／GPR54在卵巢的分布具有显著的时空特异性，在动物发情周期不同阶段的分布不同，且kisspeptin／GPR54表达水平取决于发情周期的不同阶段。Kisspeptin／GPR54在不同动物卵巢中具有高度保守的表达模式［19］。Kisspeptin／GPR54在性腺上可能以自分泌或旁分泌的方式参与动物卵泡发生［20］、卵母细胞成熟［21］、排卵［22］、颗粒细胞增殖凋亡［23-24］及类固醇合成［25］。

3 Kisspeptin／GPR54对卵泡发育的调控

3.1 Kisspeptin／GPR54直接调控卵泡发育

从幼年期到初情期，小鼠卵巢中kiss1mRNA的表达逐渐上调［26］。在初情期前，kiss1／GPR54敲除小鼠和正常小鼠的卵巢重量没有显著差异，在初情期后，kiss1／GPR54敲除小鼠与对照组小鼠相比卵巢重量和大小均显著降低［27］。研究发现，GPR54单倍体缺陷小鼠，在初情期后一直到32周龄腔前卵泡数逐渐减少［28］。D.Fernandois等［20］报道，将kisspeptin或kisspeptin受体颉颃剂P234注入6，10月龄大鼠卵巢，结果表明，卵巢注入一定量kisspeptin可使有腔卵泡数减少，排卵前卵泡和黄体数增加；相反，卵巢注入P234后有腔卵泡数增加，而排卵前卵泡和黄体数减少。人抗苗勒氏管激素（AMH）主要由次级和小腔卵泡分泌，能够抑制原始卵泡激活能力，是卵巢储备的生物标志物［29］。在6，10月龄大鼠中，注射kisspeptin会增加血浆AMH，而P234会降低血浆AMH［20］。提示kisspeptin可能通过上调AMH和下调卵泡刺激素受体（FSHR）在卵巢中的表达来负向调节窦前（包括原始、初级和次级卵泡）卵泡的发育。在初情期后，kisspeptin可促进大卵泡的进一步发育成熟，增加排卵和黄体数量。

已有研究发现，kisspeptin可能在卵巢上以旁分泌和自分泌的方式参与卵泡发育及卵母细胞成熟的调控。在绵羊中，添加kisspeptin的培养液中卵母细胞成熟比例显著高于对照组；在添加kisspeptin的各组中，10μg／mL kisspeptin10可显著提高体外培养的卵母细胞成熟率［30］。与绵羊卵母细胞体外培养的结果类似，在水牛卵母细胞体外培养中，添加10μg／mL kisspeptin10也能显著增加卵丘细胞扩张率和第一极体排出率［31］。在猪上的研究发现，特定浓度的kisspepin不但能够增加猪卵母细胞体外成熟率，而且也能促进早期胚胎发育率［21］。另外，卵泡内的kisspeptin浓度与卵母细胞成熟密切相关［32］，在一些体外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）患者中，kisspeptin54处理能够促进卵母细胞成熟，并且较安全［33］。

C-mos基因能够调节卵母细胞，通过激活细胞外信号调控蛋白酶调节成熟促进因子（MPF）的活性，c-mos还可通过抑制磷酸酶和激活下游信号通路促进胚泡破裂（GVBD）的发生［34］。已有的研究表明，在猪卵母细胞体外成熟过程中，c-mos基因表达逐渐升高［35］。GDF9和BMP15属于TGFβ超家族成员，它们在卵母细胞和卵泡颗粒细胞中均有表达，并且其基因表达随着卵泡发育及卵母细胞成熟而发生改变［36］。在体外培养中，添加一定浓度的GDF9和BMP15能够提高卵母细胞体外成熟率［37］。研究表明，一定浓度kisspeptin10能够上调猪卵母细胞中GDF9mRNA和BMP15mRNA基因的表达［21］。因此，kisspeptin可能直接作用于卵母细胞，通过上调卵母细胞中c-mos、GDF9和BMP15 mRNA的表达以提高卵母细胞的成熟率。然而，kisspeptin／GPR54直接对卵泡发育的作用，特别是腔前卵泡的发育还不清楚，kisspeptin／GPR54对卵泡发育的调控的分子机制尚未阐明，这需要做进一步研究。

3.2 Kisspeptin／GPR54间接调控卵泡发育

颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，颗粒细胞的生长发育在卵泡招募、选择和成熟的生物学过程中起着至关重要的作用。在卵泡发育过程中颗粒细胞通过间隙连接，从周围摄取各种营养物质，促进卵泡生长。不同的细胞因子通过调控颗粒细胞上的促卵泡激素受体（FSHR）和雌激素受体（ER），促使卵泡进入生长期［38］。随着卵泡的发育，颗粒细胞中芳香化酶的活性增强，会进一步提高雌激素浓度，刺激卵泡快速生长［39］。Kisspeptin在卵巢颗粒细胞中表达，通过其受体发挥作用，kisspeptin／GPR54可通过调控颗粒细胞活力及类固醇生成间接影响卵泡发育。

研究表明，kisspeptin10可以以剂量依赖方式极显著提高鸡卵巢颗粒细胞活力，促进孕酮合成［40］。在kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌影响的研究中也发现，kisspeptin10可以显著提高牛颗粒细胞活力，100 nmol／L kisspeptin10处理牛卵巢颗粒细胞24 h后颗粒细胞孕酮水平显著提高［23］。赵静等［41］检测了不同浓度kisspeptin10处理牛颗粒细胞不同时间后的细胞活力，发现不同浓度的kisspeptin10均可以极显著提高牛卵巢颗粒细胞活力。Xin X.等［42］研究发现，在猪颗粒细胞中kiss1过表达可降低G0／G1期颗粒细胞的比例，显著抑制颗粒细胞凋亡。张琳钦等［43］用kisspeptin10处理牦牛卵巢颗粒细胞，结果不同浓度kisspeptin10均能显著提高颗粒细胞活力，且kisspeptin10对孕酮分泌呈剂量依赖性增加。另外在大鼠黄体细胞中，kisspeptin虽不影响3β-HSD mRNA转录，但能上调类固醇急性调节蛋白（STAR）和CYP11A的转录，且人体绒膜促性腺激素（hCG）能够增强这一刺激效应［25］。在兔黄体中，kisspeptin通过自分泌或旁分泌的方式增加孕酮的分泌［44］。G.K.Mishra等［45］研究发现，kisspeptin上调水牛卵巢颗粒细胞中黄体生成素（LHR）、STAR、3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）、芳香化酶P450（CPY11A1）的相对表达，提示kisspeptin在水牛黄体类固醇合成中起着的重要作用。kisspeptin在犬卵巢中具有局部调控作用，卵母细胞中的kisspeptin作用于颗粒细胞中的GPR54，刺激颗粒细胞中kiss1的表达，从而促进颗粒细胞的生长发育和孕酮的生成［16］。在人上，L.A.Owens等［46］研究发现，与传统的卵母细胞成熟触发因子hCG和GnRH相比，kisspeptin54作为卵母细胞成熟诱导因子，可以使人黄体细胞中与类固醇合成有关的基因（包括FSHR、LH／hCG受体、STAR、CPY19A1、雌激素受体α和雌激素受体β、3β-HSD和抑制素A基因）表达增强，这提示kisspeptin／GPR54也在人卵巢颗粒细胞类固醇合成中起关键作用。

综上所述，在颗粒细胞中，kisspeptin通过提高颗粒细胞活力、上调类固醇合成关键酶基因表达促进颗粒细胞类固醇激素的合成，从而间接调控卵泡发育。

4 Kisspeptin／GPR54发挥生理作用的细胞内信号通路

Kisspeptin与其受体GPR54结合，通过G蛋白介导激活细胞内信号通路发挥生理作用。在GnRH细胞和下丘脑外植体中，GPR54在配体结合时激活磷脂酶C，随后将磷脂酰肌醇二磷酸分解为三磷酸肌醇和二乙酰基甘油。前者诱导细胞内内质网储存的Ca2＋外流，细胞内Ca2＋的增加导致离子通道通透性的改变，从而引起去极化反应；后者激活PKC，从而诱导MAPK激酶如ERK1／2和p38的磷酸化。二乙酰基甘油还通过激活非选择性阳离子通道和抑制内向整流钾通道刺激GnRH去极化［47］。在垂体中，kisspeptin对垂体GPR54激活的刺激是由信号通路TOR、PI3、MAPK、PLC和细胞内Ca2＋动员通路信号介导的，这与GPR54在Gn-RH神经元的作用通路非常相似［48］。此外，GPR54的激活还可以通过Arrestin-1和Arrestin-2以相反的方式调节受体信号，Arrestin-1降低GPR54介导的ERK磷酸化，Arrestin-2增强ERK磷酸化［49］。在细胞模型中，GPR54信号的脱敏是由G蛋白偶联受体中丝氨酸／苏氨酸激酶2和βarrestin介导的结果［50］。

有研究发现，使用PLC抑制剂U73122及钙离子抑制剂Verapamil能够显著抑制kisspeptin对鸡卵巢颗粒细胞孕酮分泌的促进作用，提示kisspeptin在鸡颗粒细胞中是通过调控PLC／Ca2＋来调控颗粒细胞孕酮合成的［40］。同时，在人卵巢颗粒细胞的研究中发现，kisspeptin能够诱导颗粒细胞内Ca2＋浓度的动态变化，从而调控颗粒细胞功能，但具体机制仍不清楚［46］。另外，kiss1过表达可显著增加猪颗粒细胞中PIK3CG、PIK3C1及PDK1基因的表达，而显著降低PI3K信号通路中FOXO3、TSC2及BAD mRNA水平，说明kisspeptin可能通过激活PI3K信号通路抑制猪颗粒细胞凋亡［42］。

综上所述，kisspeptin刺激GPR54存在多种信号通路，在不同细胞类型中，kisspeptin与受体GPR54结合后可能通过激活不同细胞内通路，从而发挥生理作用，从一种细胞类型的信号通路推断另一种细胞类型中的通路信号可能是行不通的。在卵巢颗粒细胞中，kisspeptin主要通过PLC／PKC／Ca2＋信号通路来调控颗粒细胞增殖分化、类固醇合成。然而，kisspeptin／GPR54在卵巢颗粒细胞中是否还存在其他信号通路仍需要做深入探索。

5 展望

近些年来，虽然大多数研究主要集中在kisspeptin／GPR54系统在HPG轴中枢调节中的功能作用，kisspeptin／GPR54系统在卵泡发育及颗粒细胞功能的调控中发挥了重要作用，然而kisspeptin／GPR54在其他诸多动物卵巢中的分布、定位及生理作用还不清楚。尽管已经有充分证据表明kisspeptin／GPR54系统不仅在卵母细胞成熟中起着关键作用，而且kisspeptin／GPR54系统可促进卵巢颗粒细胞增殖和孕激素的分泌，但其作用机制目前尚不清楚。另外，除了kisspeptin在卵巢中以内分泌或旁分泌的方式调控卵泡发育外，近些年也发现，kisspeptin／GPR54系统通过抑制血管内皮细胞生长因子的表达增加OHSS患者卵巢血管通透性，提示kisspeptin／GPR54还可能以非类固醇方式调控卵巢功能［51］。将来可利用卵巢中特定的kiss1／GPR54基因敲除动物模型来系统、深入研究kisspeptin／GPR54在卵泡发育中的作用及调控机制。还需要在其他一些尚未开展研究的动物当中进一步探讨kisspeptin／GPR54在卵巢中的定位、分布及作用。此外，kisspeptin及受体颉颃剂已开始在治疗与女性不育相关的疾病和男性精子的活力中显示出巨大的潜力［52］；然而其使用剂量、剂型及注射方式等方面仍需做进一步研究。