蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMel的构建及分析

郭新军

(西安文理学院 生物与环境工程学院，陕西 西安 710065)

作为蜂毒的主要活性成分之一[1]，蜂毒肽(Melittin)在蜜蜂体内是由其前体——蜂毒溶血肽原(Promelittin)水解而成的[2]，而蜂毒溶血肽原是蜂毒前溶血肽原(Prepromelittin)加工后的产物。蜂毒前溶血肽原包括70个氨基酸残基，由信号肽(第1至第21氨基酸残基)、低复杂性区域(第22至第43氨基酸残基)和蜂毒肽结构域(第44至第69氨基酸残基)等构成[3]。

利用基因工程技术生产蜂毒肽被看作一条有效获得蜂毒肽的途径，具有一定应用前景。前期我们构建了蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel，并在大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达，成功获得了目的融合蛋白。但由于GST标签自身相对分子质量较大，而目的蛋白又非常小，对目的片段的纯化等可能会有较大影响。笔者研究考虑到蜂毒前溶血肽原自身具有较大的溶解度，对细胞膜的破坏能力较低，尝试使用分子量较小的His标签，将改造后的蜂毒前溶血肽原基因由重组质粒pGEX-4T-1/PPMel重构到pET-28a(+)载体上，构建了pET-28a(+)-PPMel重组质粒，并对其进行生物信息学方面分析，为探讨其在原核细胞中的表达提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料与主要试剂

实验室前期对蜂毒前溶血肽原基因进行了改造并合成了改造后的基因，构建了蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel。相关材料保存于本实验室。

实验所用pET-28a(+)表达载体、大肠杆菌(E. coli)TOP10感受态细胞及T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI和SalI等分子生物学试剂均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂毒前溶血肽原基因载体更换 利用限制性内切酶EcoRI和SalI对原构建的重组质粒pGEX-4T-1/PPMel进行双酶切，同时利用限制性内切酶EcoRI和SalI对载体pET-28a(+)进行双酶切。各酶切体系(50 μL)中均包含反应模板4 μg，10×FD Buffer 5 μL，SalI 1 μl(10 U·μL-1)，EcoRI 1 μl(10 U·μL-1)，ddH2O 39 μL。酶切体系置于恒温水浴锅中37 ℃条件下反应2 h。

回收目的基因片段和酶切后的载体pET-28a(+)，利用T4 DNA连接酶将获得的目的基因片段与酶切后的载体pET-28a(+)进行连接，获得重组质粒pET-28a(+)-PPMel(图1)。连接体系(20 μL)中包含目的基因片段8 μL，酶切后载体pET-28a(+) 4 μL，10×T4 DNA ligase Buffer 2 μL，T4 DNAigase 1 μL(5 U·μL-1)，ddH2O 补充至20 μL。上述连接混合液置于PCR仪中22 ℃条件下反应1 h。

将获得的重组质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经含有50 μg·mL-1卡那霉素的平板培养过夜后筛选阳性克隆，提取重组质粒进行酶切、电泳鉴定，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序进行验证。

1.2.2 目的产物的生物信息学分析 应用ExPASy ProtParam tool(web.expasy.org/protparam/)对目的融合蛋白产物的理化性质进行分析[4]。通过SignalP-5.0 Server程序(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对目的融合蛋白进行信号肽分析[5]。同时，通过TMHMM Server v.2.0(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对目的融合蛋白进行跨膜区域分析。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的酶切检测

从大肠杆菌中提取的重组质粒，酶切后进行电泳检测。根据电泳结果可知，重组质粒经EcoRI和SalI双酶切后的产物主要为约5 000 bp和200 bp的两个片段(图2)。片段大小与预期一致，可知原重组质粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因片段已成功重构于新的载体pET-28a(+)上，获得的酶切片段中，大片段为载体质粒，小片段为插入的蜂毒前溶血肽原基因片段。

2.2 重组质粒插入片段的测序结果

插入片段的测序结果与预定改造后的蜂毒前溶血肽原基因序列一致(图3)，进一步验证了目的基因已成功插入到载体中。序列两端分别包含EcoRI和SalI酶切位点，保证了目的片段以正确的方向插入到载体中。

2.3 目的产物的生物信息学分析

插入载体后的蜂毒前溶血肽原可与载体上的相关序列连接在一起进行融合表达，且目的基因片段能与pET-28a(+)载体中的前端序列形成正确的读码框，起始密码子来自载体，终止密码子来自目的基因末端。表达的融合蛋白包括106个氨基酸残基，比设计的蜂毒前溶血肽原多36个氨基酸残基，包括6个组氨酸残基组成的His标签。蜂毒肽序列前的N-G氨基酸残基构成羟胺裂解位点[6]，可作为由融合蛋白获得蜂毒肽的切割位点(图4)。该融合蛋白的理论等电点(Theoretical pI)为6.35，带负电荷氨基酸残基10个，带正电荷氨基酸残基8个，融合蛋白不稳定系数较蜂毒前溶血肽原略有降低。

蜂毒前溶血肽原本身具有信号肽[3]，在真核细胞内可进行分泌表达。在进行融合表达时，蜂毒前溶血肽原N末端添加相应序列后，融合蛋白没有明显信号肽。信号肽的这种变化对于在原核表达系统中表达真核细胞基因的影响有待于进一步研究。

蜂毒前溶血肽原融合蛋白存在两个跨膜区，主要在融合蛋白的中间区域和C末端(蜂毒肽结构域)。

3 讨论

蜂毒肽在抗菌、消炎、抗肿瘤、肌肉再生[7～12]等方面具有一定的应用价值。在利用基因工程方法生产蜂毒肽时，可考虑用蜂毒前溶血肽原作为表达的初始产物，进一步在体外加工而获得蜂毒肽。因为与蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有较大的溶解度，且对细胞的破坏能力小[13]。

蜂毒前溶血肽原基因全长CDS序列仅213 bp，用人工合成的方法获得全序列较为方便，且易根据需要对基因进行改造。合成的基因序列可以根据需要构建到载体上，进行复制、表达或保存。也可以在需要时利用酶切和连接技术更换载体。为了实现改造后的蜂毒前溶血肽原基因与His标签等序列的融合表达，我们将原连接于重组质粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因进行了换载重构，并成功获得了重组质粒pET-28a(+)-PPMel，为进一步转化大肠杆菌感受态细胞并进行蜂毒前溶血肽原基因的表达提供了材料。

通过对相关序列的生物信息学分析，在进行融合表达时，表达出的融合蛋白与蜂毒前溶血肽原相比，其理化性质、信号肽等均发生一定的变化，这种变化对于其原核表达的影响有待于进一步研究。蜂毒前溶血肽原本身存在2个跨膜区，在进行原核表达时，可能不利于其在细胞内的表达。若要减少跨膜区，可考虑进一步对融合蛋白中间跨膜区对应的基因序列进行改造，而考虑到要保证通过原核表达产物获得的蜂毒序列不变，融合蛋白中蜂毒肽结构域的跨膜区无法去除。获得的重组质粒在进行表达时，仍需进一步摸索条件，以便顺利表达出目的蛋白，为蜂毒肽的生产提供基础。