超微粉碎预处理对玉米秸秆酶解效果的影响

李亚平，项福星，韩建国，方晓春，肖卫华，韩鲁佳

(1. 承德市农林科学院，河北 承德 067000；2. 中国农业大学，北京 100083)

随着煤炭、石油、天然气等化石资源的日益枯竭，且在开发利用过程中造成大量温室气体排放和环境污染，木质纤维作为自然界中储量最丰富的可再生资源长期以来受到研究者广泛关注[1]。作为木质纤维之一的农作物秸秆来源广泛，是储量丰富的可再生生物质资源[2]。我国是农业大国，每年各类生物质秸秆产量巨大，其中，玉米秸秆的产量最大，约为2.2 亿 t[3]，资源丰富。但利用率低，大量秸秆低效燃烧造成资源浪费，且污染环境。因此，将玉米秸秆资源化开发利用具有很大的社会经济效益，对“美丽乡村”建设、节能减排、实现低碳经济转型发挥着积极而重要的作用。

秸秆的资源化利用主要表现在利用纤维素酶等酶降解玉米秸秆转化为还原糖，然后发酵生产燃料酒精、单细胞蛋白(SCP)及乳酸等有机酸物质[4～6]。玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素以及木质素组成，由于纤维素分子内和分子间存在着大量的氢键，并在固态下聚集成不同水平的结晶性原纤结构，以及木质素、半纤维素对纤维素的保护作用，使得秸秆显示出刚性和高度水不溶性，对试剂的可及度低，溶解困难，反应均一性差[7～8]。因此，要对其进行预处理，提高酶解效率。

尽管已有学者对玉米秸秆酶解做了大量研究[4,6,9]，但对短时间超微粉碎预处理对酶解效果的影响研究甚少[10]。因此笔者拟采用短时间超微粉碎预处理手段对玉米秸秆进行预处理，并对预处理后的玉米秸秆样品进行酶解试验研究。探究不同预处理时间对玉米秸秆粒径分布和酶解后总还原糖及葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖等各种糖产量的影响，同时分析比较原样和超微粉碎预处理样品酶解的固体回收率、葡萄糖收率，研究超微粉碎预处理对玉米秸秆酶解效果的影响，以期对生物质秸秆的资源化利用和工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

玉米秸秆，采自承德市农林科学院“现代农业科技创新基地”。取回后于通风处自然晾干，粉碎至40目后封装于密封袋中室温避光保存备用。

葡萄糖(≥99.5%)、阿拉伯糖(≥99%)、纤维素酶(Cellulast 1.5L)、纤维二糖酶(Novozyme 188)和pNPG来自 Sigma；木糖(≥99%)和纤维二糖(≥99%)来自Sigma-Aldrich；氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、酒石酸钾钠和一水合柠檬酸等均为分析纯，来自北京化工厂；偏重亚硫酸钠，分析纯，来自西陇化工股份有限公司；pNP，分析纯，来自百灵威科技有限公司；四环素盐酸盐，分析纯，来自北京蓝弋化工产品有限责任公司。

1.2 主要仪器与设备

RT-34静音研磨粉碎机：香港荣聪精密科技有限公司；CJM-SY-B高能纳米球磨粉碎机：秦皇岛市太极环纳米制品有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计：SHIMADZU公司；Waters e2695高效液相色谱仪：Waters公司；Mastersizer 3000激光粒度仪：Malvern公司；XS205电子天平：METTLER TOLEDO公司；SevenEasy pH计：METTLER TOLEDO公司；Milli-Q超纯水系统：MILLIPORE公司；SHA-B(A)水浴恒温振荡器：金坛市科析仪器有限公司；TW 20恒温水浴锅：优莱博仪器有限公司。

1.3 玉米秸秆超微粉碎预处理

用高能纳米球磨粉碎机对玉米秸秆 40 目粗粉样品进行超微粉碎，超微粉碎过程中不添加任何助磨剂、抗结块剂，用循环冷却水保持罐体温度低于 30 ℃。选用强化不锈钢磨罐，氧化锆球作为磨介质，球料体积比 2∶1，球磨介质填充率为 35%，分别干法粉碎 0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h，将得到的样品分别装入密封袋内室温避光保存，分别命名为 BM0 h(即秸秆原样)、BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h。

1.4 粒径分布

笔者试验采用马尔文公司的 MASTERSIZER 3000 激光衍射技术测量不同球磨时间的玉米秸秆的粒径分布。系统由样品分散装置、光学平台和软件三部分构成。样品用 Aero S 干法附件分散，当激光束穿过分散的颗粒时，通过测量散射光强来完成粒度测定[11]。测定时，取适量玉米秸秆粉体放于样品分散装置入口，空气做为分散介质进行测量，测定粒径范围为0.01～3 000 μm。粒径大小以中值粒径表示，粒径均匀度用粒径跨度[12]表示。每个样品测量 3 次。粒径跨度如公式1所示。

粒径跨度= (D90-D10)/D50

(1)

其中：D50、D10和D90分别代表粉体样品累计分布百分数分别达到 50%、10%、90%时所对应的粒径大小。

1.5 分析测定方法

纤维素酶滤纸酶活参照美国国家可再生能源实验室(National Renewable Energy Laboratory，NREL)的 NREL/TP-510-42628 标准方法[13]测定。纤维二糖酶活力采用 pNPG 法测定[14]。采用 Miller 的 3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[15]测定酶解滤液中的总还原糖含量，每个样品进行 2 个重复测定。参考美国国家可再生能源实验室(NREL)的NREL/TP-510-42623 标准方法[16]，测定酶解滤液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖等各种糖的含量。

1.6 酶解方法

对玉米秸秆原样、超微粉碎预处理后样品分别进行72 h酶解试验。称取7 g样品于500 mL的锥形瓶中，加入140 mL用 pH4.8 的柠檬酸钠缓冲溶液稀释的纤维素酶和纤维二糖酶混合液，使酶解过程中干物质的含量达到 5%(w/v)，混合液中纤维素酶的加载量为 20 FPU·g-1干物质，纤维二糖酶的加载量为 40 CBU·g-1干物质，同时为避免酶解过程中微生物的干扰，在混合液中加入 0.08 g·L-1的四环素盐酸盐。充分混匀后，将所有的锥形瓶用保鲜膜密封好，放入水浴恒温振荡器中，在 50 ℃、150 rpm 的条件下进行酶解反应，72 h 后离心分离，取出上清液用于测定总还原糖含量和葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖等各种糖含量，固体部分用去离子水多次冲洗至中性后，真空冷冻干燥 24 h 后测定固体回收率。

1.7 固体回收率的测定

固体回收率通过公式(2)进行计算：

固体回收率=(m1/m2)×100

(2)

式中，m1代表预处理后或酶解后玉米秸秆质量，g；m2代表预处理前或酶解前玉米秸秆质量，g。

1.8 葡萄糖收率

酶解后葡萄糖收率是指秸秆残渣酶解后所产生的葡萄糖量与用于预处理的秸秆中纤维素完全水解理论上应该产生的葡萄糖的总量之比[17]。葡萄糖收率的计算如公式3所示。

葡萄糖收率(%)=ab/(c/0.9)×100

(3)

式中，a表示预处理后玉米秸秆的固体回收率；b表示秸秆酶解后葡萄糖产量，mg·g-1；c表示玉米秸秆原样中的纤维素含量，此处c=30.50%；0.9 为葡萄糖与纤维素间的质量转化系数。

2 结果与分析

2.1 粒径分布

激光粒度法是目前测定粉体粒径一个常用的方法，能直观反映粉体的平均粒径和粒度累计分布。不同超微粉碎时间后玉米秸秆粉体的的D10、D50、D90、粒径跨度和平均粒径分布曲线分别如表1和图1所示。

表1 不同超微粉碎时间玉米秸秆粉体的D10、D50、D90和粒径跨度

由表1可看出，在超微粉碎0～1.5 h期间，随着粉碎时间的延长，中值粒径减小，并在BM1.5 h时达到最小值8.23 μm，说明经超微粉碎后，能有效减小其粉体平均粒径，同时粉碎时间越长，其平均粒径越小，在超微粉碎1.5 h时，玉米秸秆粒径尺寸达到表观粉碎极限。延长粉碎时间到2 h发现，D10、D50和D90相比BM1.5 h都有所增加。这可能是粉碎时间达2 h时，粉体中出现团聚现象，因分子间力大于破碎力，粉体中有小颗粒附着在大颗粒表面，形成部分大颗粒，导致平均粒径增大[18～19]。粒径跨度表示粒径的均匀度、粒度分布范围，粒径跨度越小表示粒径越均匀，粒度分布范围越窄[12]。 由表1可看出，当玉米秸秆经超微粉碎后，粒径跨度增大，说明超微粉碎后粒径均匀度不如粗粉样品。

由图1可看出，相比于粗粉样品，玉米秸秆超微粉碎后平均粒径分布曲线整体左移，这是由于超微粉碎破坏了玉米秸秆的维管束[20]。由表1可知，超微粉碎后样品的D50均小于30 μm，表明超微粉碎后颗粒向微细化发展，且已粉碎到细胞尺度[21]。

2.2 酶解糖产量

选择玉米秸秆原样、超微粉碎预处理后玉米秸秆(BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h)进行酶解72 h试验。测定酶解72 h后总还原糖及葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖等各种糖产量如图2所示。总还原糖产量指酶解后产生的包含本试验中葡萄糖等4种糖在内的所有还原糖产量的总和。玉米秸秆原样直接酶解后还原糖产量是155.05 mg·g-1，BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h酶解后还原糖产量分别为346.48 mg·g-1、466.80 mg·g-1、530.27 mg·g-1、613.60 mg·g-1，分别是原样直接酶解的2.23倍、3.01倍、3.42倍、3.96倍。玉米秸秆原样直接酶解后葡萄糖产量是90.43 mg·g-1，BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h酶解后葡萄糖产量分别为198.03 mg·g-1、267.39 mg·g-1、307.55 mg·g-1、351.47 mg·g-1，分别是原样直接酶解的2.19倍、2.96倍、3.40倍、3.89倍。由图可知，在0～2 h内，预处理时间越长，酶解后总还原糖及葡萄糖等各种糖产量均越高。这是由于超微粉碎主要通过碰撞、挤压和研磨等降低物料粒径和增大比表面积和孔体积，使表面多糖物质含量升高、木质素和抽提物含量降低、增大纤维素表面积和木质素表面积、降低结晶度，增加酶作用位点[22～24]，酶解效率相对于原样提高很多，且在0～2 h内，预处理时间越长，酶解效率越高。

2.3 酶解后固体回收率

玉米秸秆原样和经过预处理后样品酶解72 h的固体回收率如图3所示。由图可知，固体回收率随预处理时间延长而降低。原样酶解后产糖量很低，固体回收率较高，为72.86%。超微粉碎预处理0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后，酶解固体回收率分别为61.50%、49.46%、42.02%、37.46%，依次降低。预处理时间越长，酶解时产糖量越高，水解程度越高，所剩固体残渣越少，固体回收率越低。与产糖量结果一致。

2.4 葡萄糖收率

葡萄糖收率可以反映酶解过程中秸秆中纤维素的降解程度，一定程度上反映了秸秆的酶解效率。葡萄糖收率越高，表示纤维素降解程度越高，酶解效率越高[17]。玉米秸秆原样和预处理样品酶解72 h的葡萄糖收率见表2。由表2可看出，原样直接酶解后葡萄糖收率较低，为26.68%，超微粉碎预处理后酶解的葡萄糖收率升高，且预处理时间越长，葡萄糖收率越高。超微粉碎预处理2 h的葡萄糖收率高达98.57%，酶解效率相比原样提高了2.69倍。由此可见，超微粉碎预处理对酶解具有重要的促进作用。

表2 玉米秸秆原样和预处理样品酶解72 h的葡萄糖收率

3 结 论

(1)超微粉碎能有效减小玉米秸秆粉体平均粒径，同时粉碎时间越长，其平均粒径越小，在超微粉碎1.5 h时，玉米秸秆粒径尺寸达到表观粉碎极限。延长粉碎时间达2 h时，粉体中出现团聚现象，因分子间力大于破碎力，粉体中有小颗粒附着在大颗粒表面，形成部分大颗粒，导致平均粒径增大。超微粉碎后样品的D50均小于30 μm，表明超微粉碎后颗粒向微细化发展，且已粉碎到细胞尺度。

(2)在0～2 h内，预处理时间越长，酶解后总还原糖及葡萄糖等各种糖产量均越高。BM2.0 h酶解还原糖和葡萄糖产量分别是玉米秸秆原样直接酶解的3.96倍、3.89倍。超微粉碎预处理可以大幅度地提高秸秆酶解糖产量。

(3)玉米秸秆原样酶解72 h的固体回收率较高，为72.86%。超微粉碎预处理时间越长，酶解时产糖量越高，水解程度越高，所剩固体残渣越少，固体回收率越低。

(4)原样直接酶解后葡萄糖收率较低，为26.68%。超微粉碎预处理后酶解的葡萄糖收率升高，且预处理时间越长，葡萄糖收率越高。超微粉碎预处理2 h的葡萄糖收率高达98.57%，酶解效率相比原样提高了2.69倍。由此可见，短时间超微粉碎预处理可促进秸秆降解为还原糖，提高酶解效率，对酶解具有重要的促进作用。