外源糖类和维生素对莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi孢子萌发的促进作用

刘守柱　刘双双　姜武玲　王馨玫　王文杰

摘要：莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi是重要的昆虫病原真菌，对鳞翅目害虫有很好的防治效果，但存在杀虫速度慢的缺点。为了提高莱氏绿僵菌孢子的萌发速度，缩短对寄主的致死时间，在孢子悬液中分别添加不同糖类和维生素类，以测定外源营养对莱氏绿僵菌孢子萌发的促进作用。配制含有不同浓度糖和维生素的SMY液体培养基后，接种M.rileyi孢子，25℃、180 r/min振荡培养，每隔24 h，用血球计数板镜检孢子萌发率。结果表明：接种24 h后，以10 g/L甘露糖、5 g/L维生素B6和5 g/L维生素C对孢子萌发的促进作用较好，孢子萌发率分别为3.50%、3.67%和0.83%;随着培养时间延长，10 g/L甘露糖、5 g/L维生素C依然对孢子萌发有较好的促进作用，5 g/L维生素B6对孢子萌发的促进作用逐渐降低;进一步测定甘露糖和维生素C对孢子萌发的浓度效应，甘露糖浓度为25.0 g/L时对孢子萌发的促进作用最好，维生素C浓度为0.2 g/L时最好。以上结果表明，对M. rileyi孢子萌发促进效果最好的外源营养是甘露糖和维生素C，最适浓度分别是25.0 g/L和0.2 g/L。

关键词：莱氏绿僵菌;孢子萌发;糖;维生素

中图分类号：S476.12文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）03-0097-05

AbstractMetarhizium rileyi is an important entomopathogenic fungus with good control effect against Lepidopteran pests， while its insecticidal speed was slow. Hence， the promotion effects of external saccharides and vitamins on spore germination of Metarhizium rileyi were analyzed to find a way to shorten the lethal time and improve the spore germination speed of M. rileyi on host. The conidia of M. rileyi were inoculated into 6 saccharide and 4 vitamin fluid media， and cultured in the conditions of 25℃ and 180 r/min on the incubator shaker;the germinated spores were counted by hemocytometer under microscopy every 24 h after inoculation. The results showed that 10 g/L mannose， 5 g/L vitamin B6 and 5 g/L vitamin C had better promotion effects on spore germination after 24 h， and the spore germination rates were 3.5%， 3.67% and 0.83% respectively. With the extension of culture time， 10 g/L mannose and 5 g/L vitamin C still had better promoting effects on spore germination， while the promoting effect of 5 g/L vitamin B6 gradually decreased. Further study showed that mannose had the best promotion effect when the concentration was 25.0 g/L， while the optimum concentration of vitamin C was 0.2 g/L. It was concluded that mannose and vitamin C were the best external nutrients in promoting spore germination of M. rileyi at the concentrations of 25.0 g/L and 0.2 g/L，respectively.

KeywordsMetarhizium rileyi; Spore germation; Saccharide; Vitamin

萊氏绿僵菌（Metarhizium rileyi）隶属于子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麦角菌科（Clavicipitacea）绿僵菌属（Metarhizium），旧称莱氏野村菌Nourmeae rileyi[1]，是一种在自然界广泛分布的昆虫病原真菌，对多种鳞翅目害虫，尤其是夜蛾科害虫，如甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[2，3]、棉铃虫（Helicoverpa armigera）[4]、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）[5，6]、新入侵我国的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）[7]等，共计60多种害虫[8]均有明显的致病作用，是一种具有广阔应用前景的生防真菌。昆虫被M. rileyi侵染死亡后，虫体僵硬，菌丝由内向外穿透体表，在僵尸表面大量产孢，形成绿色霉层。成熟孢子在田间可借助气流、水流进行扩散传播，黏附到其他虫体表面后，孢子萌发形成再侵染，导致昆虫疾病在一定的区域内自然流行，因而可以长久控制害虫的种群数量，这种疾病流行能力可以在田间人工诱导发生[9]。

M. rileyi的侵染过程起始于孢子在昆虫体壁表面的萌发。孢子萌发后产生芽管，然后芽管分泌几丁质酶[10]等降解昆虫表皮，穿透体壁后进入血腔，完成侵染过程。由此可见，M. rileyi孢子的萌发能力与侵染成功的几率有直接的联系，萌发速度快，萌发率高，相应会提高病原菌的侵染成功率和致死效果。在自然条件下，孢子黏附到昆虫体表后，由于昆虫上表皮坚硬、疏水性强、缺少游离的营养物质[11]，因而孢子处于外源营养极度贫乏的状态，仅能依靠自身储备营养进行萌发。如果在此过程中，添加适量的营养物质，如油类和糖类，能协助或促进孢子萌发的几率[12]，延长芽管生存时间，必将会提高病菌的侵染、致死效果。

为了提高M.rileyi分生孢子在营养缺乏状态下的萌发几率，增强对害虫的寄生作用，本研究以较为常见且水溶性较好的糖类和维生素类作为外源营养，在离体条件下测定两类物质对孢子萌发的促进作用，以期为提高M. rileyi 的田间应用效果提供有益借鉴。

1材料与方法

1.1供试菌株

M. rileyi Nr5772菌株，聊城大学农学院昆虫研究室提供。菌种用萨氏麦芽糖琼脂酵母（SMAY）固体培养基进行继代培养，连续培养4～5代后接种至斜纹夜蛾幼虫体内进行复壮，再次纯化后保存备用。

1.2供试糖及维生素

选择葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘露糖6种糖类及维生素C、维生素B1、维生素B3、维生素B6 4种维生素类作为外源营养，测定其对M. rileyi孢子萌发的影响。

1.3孢子萌发的测定

在无菌条件下，用挑针挑取适量孢子粉，转移到含有0.10 g/L吐温80的无菌水中，充分振荡混匀后，用血球计数板计数后，调整孢子浓度为每毫升1×107个，备用。

1.3.1外源糖类和维生素对孢子萌发的影响称取0.2 g糖类，加入到150 mL三角瓶中，然后加入19 mL无菌水使之充分溶解，再加入1 mL配好的孢子悬浮液，配成糖浓度为10 g/L的孢子悬浮液，25℃、180 r/min振荡培养，以不加糖的孢子悬浮液作为对照组。相同方法，分别称取维生素0.1 g，配制维生素浓度为5 g/L的孢子悬浮液，以测定不同种类维生素对孢子萌发的影响。所有处理均重复3次。

1.3.2孢子萌发测定每隔24 h用光学显微镜观察、记录孢子萌发情况。观察时，从各组处理当中移出少量培养液，在显微镜下用血球计数板观察孢子的萌发情况并计数，记录各时间孢子的萌发个数，并计算出各时间的孢子萌发率。共观察96 h。

1.3.3外源糖类和维生素对孢子萌发的浓度效应根据1.3.2的测定结果，选择对孢子萌发促进效应最好的糖和维生素，分别设置0.2、1.0、5.0、25.0、100.0 g/L系列浓度，测定不同浓度下孢子的萌发率，以确定浓度对孢子萌发的影响。

1.4数据统计分析

所有数据采用Microsoft Excel 2016软件进行计算，采用STDEV.P函数进行误差估计;多重比较采用DPS 7.05软件Duncans新复极差法进行。

2结果与分析

2.1外源糖类对M.rileyi孢子萌发的促进作用

振荡培养24 h，M. rileyi孢子在10 g/L蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、阿拉伯糖溶液中未见萌发或极少萌发，表明以上糖类在供试浓度下对孢子萌发没有促进作用;而在10 g/L甘露糖溶液中M. rileyi孢子平均萌发率3.5%，明显好于其他糖类（表1）。经方差分析，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、阿拉伯糖处理组与对照组差异不显著，与甘露糖处理差异显著。

培养48 h，各处理以及对照组孢子均有不同程度萌发，但仍以10 g/L甘露糖处理组的萌发率最高。10 g/L葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、阿拉伯糖处理组孢子萌发率虽然低于甘露糖处理，但明显高于对照组，说明以上糖类也有促进孢子萌发的作用。

培养72～96 h，随着培养时间的延长，蔗糖和葡萄糖处理组的孢子萌发率快速升高，与甘露糖处理组相近，说明蔗糖和葡萄糖对孢子萌发的促进作用在培养的后半段较为显著。

2.2外源维生素对M.rileyi孢子萌发的促进作用

培养24 h，M. rileyi孢子在维生素B6和维生素C溶液中萌发，而在维生素B1、维生素B3和对照处理中未见萌发。其中，维生素B6的促进作用好于维生素C（表2）。

培养48 h，各种维生素及对照溶液中均有孢子萌发，其中维生素B6处理的萌发率最高，其次为维生素C处理，两者间差异不显著，但显著高于其他处理。

培养72 h，维生素C处理中的孢子萌发率最高，达44.17%，显著高于维生素B6（12.33%）及其他处理的萌发率。前期表现较好的维生素B6萌发率涨幅不大，说明持效性较差。持续培养至96 h，各处理之间的趋势与培养72 h时基本一致。

綜合表1和表2，10 g/L甘露糖、5 g/L维生素C在培养24～48 h内对孢子萌发有明显的促进作用，并且有比较好的持效性，因而选择二者作为孢子萌发促进剂，进行下一步的浓度效应测定。虽然5 g/L维生素B6在24～48 h阶段内也有很好的促进作用，但后期增幅不大;与之相反，10 g/L葡萄糖溶液在72～96 h阶段内有很好的促进作用，但在24～48 h内促进萌发的作用较低，说明维生素B6和葡萄糖对孢子萌发的整体效果较差，因而不能作为良好的孢子萌发促进剂。

2.3甘露糖促进M.rileyi孢子萌发的浓度效应

在不同浓度甘露糖溶液中，M. rileyi孢子的萌发率变化趋势相似（图1），即在0.2～25.0 g/L范围内，孢子萌发率随着糖浓度的升高而增高，此后快速下降;最有利于孢子萌发的甘露糖浓度为25.0 g/L。在相同浓度甘露糖溶液处理下，随着培养时间的延长，萌发率总体来说呈升高趋势。

2.4维生素C促进M.rileyi孢子萌发的浓度效应

从图2中可以看出，M. rileyi孢子在低浓度维生素C溶液中萌发率较高，在高浓度溶液中萌发率较低，萌发率与维生素C浓度呈明显的负相关关系，最有利于孢子萌发的浓度为0.2 g/L。在相同浓度维生素C溶液处理中，孢子萌发率随培养时间的延长而升高。

3讨论与结论

众所周知，生物防治是害虫综合治理的重要方法，以其良好的环境安全性和对人畜的低毒性而在农业生产尤其是蔬菜生产中广泛应用。据统计，从2013—2017年，国际期刊发表的生物防治论文以每年20%的速度稳步递增[13]，说明该领域吸引了众多研究人员参与，具有广阔发展前景。虽然生物防治有其独具的优点，但也有严重的应用瓶颈，例如严重依赖环境条件、效能低、致死速度慢等[14-16]，这在利用昆虫病原真菌防治害虫时尤为突出。

前期研究已经表明，导致莱氏绿僵菌杀虫速度慢的主要障碍是昆虫的体壁防御，一旦病原菌穿透寄主体壁（cuticle penetration）进入血腔，即使病原菌数量仅为400个/幼虫，亦可在3天内致寄主死亡[17]。M. rileyi孢子的体壁穿透效率低是其杀虫速度慢的主要原因，在此过程中，孢子的萌发率与体壁穿透率有直接关系，相同条件下孢子萌发率高必然提高体壁穿透效率，最终缩短致死时间。因而，提高孢子萌发率，尤其是研究有利于提高孢子萌发率的剂型，一直是生防真菌应用研究中的重要内容[18-20]。

从本研究结果看，除了研究有利于保存孢子萌发率的剂型以外，额外添加一些外源营养物质作为孢子萌发促进剂，也可以明显提高孢子萌发率，且以甘露糖和维生素C的效果最佳。进一步研究表明：甘露糖的最适质量浓度为25.0 g/L，浓度低时对M. rileyi孢子萌发的促进作用较低，而高时则出现抑制作用;维生素C在低浓度时对孢子萌发促进作用明显，高浓度时有抑制作用，最适质量浓度为0.2 g/L。根据以上结果，在制备M. rileyi分生孢子制剂或者在田间应用时，可以人工添加适量的甘露糖或维生素C作为孢子萌发促进剂，以提高生防效果。

需要指出的是，本研究结果是在室内离体条件下测定的，并不能如实反映出活体条件下的促进作用。许多因素，例如活体昆虫上表皮及微观结构是否能吸收或消化额外添加的外源营养，孢子-外源营养-昆虫表皮三者之间的互作机制，均可以影响到外源营养对孢子萌发的促进作用，因此能不能在活体昆虫体壁表面也取得相同的效果尚需进一步试验确定。

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