4个芍药品种与3个牡丹品种的远缘杂交结实特性研究

祁奇墨　孟凡志　国静　邢广萍　郭先锋

摘要：开展芍药与牡丹远缘杂交研究对于保障我国芍药产业的可持续发展具有重要意义。本研究以课题组前期筛选出的4个结实率较高的芍药品种为母本，以3个牡丹品种为父本，设计12个杂交组合，以饱满种子数、结实心皮率、百粒重等作为评价指标，对比筛选各杂交组合的结实情况。结果如下：筛选出杂交亲和性高的4个组合，分别为‘紫凤羽ב月宫烛光、‘紫凤羽ב层中笑、‘紫凤羽ב花王、‘矮粉1号ב层中笑，其每果饱满种子数分别为16.50、12.00、9.13、2.57粒，结实心皮率分别为52.50%、60.00%、4706%和73.68%。本研究结果对于进一步培育芍药属新品种具有重要的指导价值。

关键词：芍药;牡丹;远缘杂交;结实特性

中图分类号：S682.1+20.36+S567.1+50.351文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）03-0024-05

Abstract The study of distant hybridization between herbaceous peony and tree peony is of great significance for safeguarding the sustainable development of peony industry in China. In the study， twelve distant hybridization combinations were designed with four herbaceous peony cultivars as female parents and three tree peony cultivars as male parents. The seed-setting characteristics were compared according to the parameters such as the number of full seeds， ratio of fertile carpels and 100-seed weight. The results showed that four combinations with high cross compatibility were screened out， including ‘Zi FengyuבYuegong Zhuguang， ‘Zi FengyuבCengzhong Xiao，‘Zi FengyuבHuawang and ‘Aifen 1בCengzhong Xiao. The number of full seeds per follicle of the four combinations were 16.50， 12.00， 9.13 and 2.57， respectively， while the ratio of fertile carpels were 52.50%， 60.00%， 47.06% and 73.68%， respectively. These results would provide significant references for further breeding new varieties in Paeonia.

Keywords Herbaceous peony; Tree peony;Distant hybridization; Seed setting characteristics

芍药（Paeonia lactiflora Pall.）是芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）的多年生草本植物，是中国的传统名花，广泛栽培于园林绿地。芍药与牡丹虽为同属植物，但前者为草本，属于芍药组[1]，后者为木本，属于牡丹组，二者间杂交属于组间的远缘杂交，这种组间杂交长期以来被认为极具挑战性[2]。与大多数植物远缘杂交一样，牡丹与芍药的远缘杂交往往表现出杂交不亲和、胚败育以及杂种不育的特性[3]，而杂交亲和性与亲本的遗传型有密切关系，因此找到适宜的亲本或亲本组合是杂交成功的关键。目前国内对芍药结实特性尤其是远缘杂交方面的研究较少，随着近些年来国外组间远缘杂交的不断成功[4，5]，我国学者也开始在芍药属组间杂交方面进行一些有益的尝试，例如：张栋通过组间杂交的方式，从48个杂交组合中收获1 715粒种子[6];王越岚以川赤芍作为父本、牡丹作为母本进行反交，平均结实11.63粒/朵[7]。

本课题组前期通过对芍药品种性状的调查研究，筛选出4个结实率较高的芍药品种，并对芍药和牡丹的远缘杂交进行了试验，收获了一定数量的种子。在此基础上，本试验选择‘凤凰涅槃、‘矮粉1号、‘迷你、‘紫凤羽4个结实特性优良的芍药品种为母本，采用3个具有优良性狀的牡丹品种作为父本进行人工授粉杂交，调查分析其结实特性，以期探究特定远缘杂交对芍药结实特性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以本课题组前期筛选出的‘凤凰涅槃、‘迷你、‘紫凤羽和‘矮粉1号4个结实率较高的芍药品种为母本，以‘层中笑、‘花王和‘月宫烛光3个牡丹品种为父本，共计12个杂交组合。每个杂交组合授粉25朵花，分别以母本芍药天然异花授粉为对照。父母本植株均种植于山东农业大学南校区试验基地，管理水平良好，植株生长健壮。

1.2 试验方法

1.2.1 父本花粉采集与萌发率测定 在牡丹含苞欲放期采集花粉，阴干，分装于离心管中，置于4℃冰箱中保存。采用液体培养基（10 g蔗糖+0.1 g硼酸+100 mL蒸馏水）培养花粉并测定花粉萌发率[8]。培养条件为25℃，黑暗培养6 h，每个品种3个重复。OLYMPUS光学显微镜下观察并拍照。花粉管萌发长度大于或等于花粉粒直径视为花粉萌发。花粉萌发率=萌发花粉粒数/花粉粒总数×100%。

1.2.2 人工授粉 2019年5月初，每株选取5朵含苞待放的主蕾花朵，于花药尚未散粉前去除全部雄蕊，去雄后立即用硫酸纸袋套住花苞。待柱头大量分泌粘液时，人工授予父本花粉，经常观察授粉情况，对授粉效果较差的花朵进行补授。授粉后立即套好硫酸纸袋，并注明杂交组合、授粉时间等信息。授粉后约7 d时，摘除硫酸纸袋，避免雌蕊霉烂。

1.2.3 杂交结实率统计 2019年8月上旬于芍药蓇葖果稍稍开裂、种子尚未脱落时，收获蓇葖果。分别统计和计算如下指标：蓇葖果重量（g）、心皮数（个/蓇葖果）、结实心皮数（个/蓇葖果）、饱满种子数（粒/蓇葖果）、不饱满种子数（粒/蓇葖果）、每心皮种子数（粒）、百粒重（g）、结实胚珠率（%）和结实心皮率（%）。其中，结实心皮率（%）=结实心皮数/蓇葖果心皮数×100。

1.2.4 数据分析 采用SPSS 19.0、Microsoft Excel和GraphPad Prism 8.0软件对试验数据进行分析及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 父本花粉的萌发特性

对采集的‘层中笑、‘花王和‘月宫烛光3个牡丹品种的花粉进行萌发率测定，结果显示：‘层中笑和 ‘花王花粉萌发率高达近90%，‘月宫烛光花粉萌发率较低，为65.57%（图1）。3个牡丹品种的花粉萌发率均高于60%，适宜作为父本进行杂交授粉试验[8]。

2.2 母本的自然结实特性

4个母本芍药品种自然授粉情况下的结实特征见表1，可以看出：4个芍药品种的心皮数具有差异，‘迷你最多，平均为6个;其次为‘凤凰涅槃和‘紫凤羽，为5个，‘矮粉1号为4个。结实后，蓇葖果重量、结实心皮率、饱满种子数、每心皮种子数、结实胚珠率都是衡量结实特性的重要指标，据此，‘凤凰涅槃最优，其次为‘迷你，二者均明显优于另外2个母本品种。百粒重是衡量种子质量的重要指标，4个品种间比较，‘凤凰涅槃>‘矮粉1号 >‘紫凤羽>‘迷你。综合来看，‘凤凰涅槃的自然结实性状最优。

2.3 不同杂交组合的结实特性

不同杂交组合收获的饱满种子数见图2，从中可知，以 ‘紫凤羽为母本收获种子数最多，共118粒;其次为以‘矮粉1号为母本，共收获种子19粒;以‘迷你和‘凤凰涅槃为母本收获种子数很少，尤其以‘凤凰涅槃为母本，仅‘凤凰涅槃ב花王组合收获1粒种子。各杂交组合中，‘紫凤羽ב花王组合收获的种子数最多，达到73粒;‘紫凤羽ב月宫烛光组合收获种子数也较多，为33粒;‘矮粉1号ב层中笑、‘紫凤羽ב层中笑组合分别为18粒和12粒;其余组合均少于3粒或没有饱满种子。

由表2可见，杂交组合‘紫凤羽ב花王的结实蓇葖果数最多（8个），虽其每果不饱满种子数也最多，但每果仍约有9粒饱满种子，因此其收获的饱满种子最多。‘矮粉1号ב层中笑的结实蓇葖果数也较多（6个），但其每果饱满种子数平均仅2.57粒，因此该杂交组合收获的饱满种子数较少。而‘紫凤羽ב月宫烛光虽仅有2个结实蓇葖果，但其每果饱满种子数最多，达到平均16.50粒，最终该组合收获的饱满种子数明显多于‘矮粉1号ב层中笑组合。根据百粒重，‘紫凤羽为母本的3个定向杂交组合均高于其自然结实，而‘矮粉1号为母本的杂交组合‘矮粉1号ב层中笑百粒重略低于‘矮粉1号自然结实百粒重。每果结实心皮率，4个较优的杂交组合为 ‘矮粉1号ב层中笑（7368%）、‘紫凤羽ב层中笑（60.00%）、‘紫凤羽ב月宫烛光（52.50%）、‘紫凤羽ב花王（47.06%）。

2.4 芍药与牡丹杂交种子发育观测

根据12个杂交组合收获时的蓇葖果发育状态，我们发现形成饱满种子的蓇葖果中，虽然不同杂交组合饱满种子与不饱满种子数量存在差异，但所有种子外种皮均变为褐色，且蓇葖果内未见黏液存在（图3）。

未形成种子的则主要有两种类型：多数败育组合的蓇葖果心皮膨大，正常发育，但蓇葖果内胚珠未发育，并且在收获时蓇葖果心皮内仍有未干黏液存在（图4A），可能是胚珠未受精成功;还有一些蓇葖果内有少数胚珠发育膨大，但是未发育形成饱满种子，虽外种皮变为褐色，但是种皮凹陷皱缩，干扁，剥开后发现内空，明显败育，蓇葖果心皮内未见黏液（图4B）。

3 讨论与结论

尽管我国是芍药属植物的主要原产地[9，10]，但国外对于芍药新品种的培育却远远领先于我国，其重要原因之一就在于杂交育种时设计亲本组合的广泛程度远远超过我国[11]。本研究通过对12个芍药与牡丹杂交组合结实性的调查分析，筛选出4个结实性较高的远缘杂交组合，为进一步开展芍药属植物杂交育种实践提供了种质材料。

前人在選择芍药母本时常用单瓣型的‘粉玉奴[12，13]，郝青等发现并鉴定的我国第一例伊藤杂种‘和谐就是以‘粉玉奴为母本材料培育出的[14]。但‘粉玉奴自然状态下结实率较低[7]。本试验选用的4个芍药品种在自然授粉情况下结实率相对较高（19～41粒/果），但在与牡丹进行远缘杂交时，即使父本相同，[JP2]其结实情况也明显不同，例如在以‘层中笑为父本的杂交组合中，根据获得饱满种子的数量，其排序依次为‘矮粉1号ב层中笑（18）>‘紫凤羽ב层中笑（12）>‘迷你ב层中笑（1）>‘凤凰涅槃ב层中笑（0）。[JP]‘凤凰涅槃在自然授粉结实情况下的所有结实特性指标均高于其他3个芍药品种，但与3个牡丹品种的杂交组合中，授粉75朵花，却只收获到1粒成熟饱满种子。通过对‘凤凰涅槃开花进程的观察，发现其存在花粉早熟现象，即花苞尚未开放前，花粉已经成熟散粉，并且花柱头分泌黏液也较早，花朵开放2～3天即大量分泌黏液，说明‘凤凰涅槃存在雌雄蕊双重早熟的特性，这些因素可能导致了其人工杂交不亲和、结实率低。

父本花型和花粉活力是杂交亲和性和结实率的重要影响因素，选择花粉活力较高的父本能显著提高结实率[15，16]。本研究的3个父本牡丹品种分属于中原牡丹品种群、日本牡丹品种群和紫斑牡丹品种群，花粉活力均大于60%，分别为8843%（‘层中笑）、8848%（‘花王）、65.57%（‘月宫烛光），但与芍药杂交后的结实率并不呈正相关。例如，以‘紫凤羽为母本的杂交组合中，按照结实率由高到低的顺序，其父本依次是‘月宫烛光、‘层中笑、‘花王。这种不一致性充分表明，在父本花粉活力超过60%的前提下，杂交组合的结实率高低与父本花粉活力没有必然关联。

芍药与牡丹亲缘关系较远[17]，杂交时往往存在杂交障碍，可能是受精前障碍，也可能是受精后障礙，或者二者兼而有之，均影响其结实性[18，19]。为判断杂交障碍类型，以往研究往往采用荧光显微观测法或石蜡切片法，前者授粉后72小时内定期取样，后者则在授粉后到种子成熟期间定期取样[7]，不仅繁琐，而且浪费了大量宝贵的杂交组合材料。本研究在种子成熟时取样观测，并结合结实特性数据，可基本判定不同杂交组合的主要不亲和类型，例如图4所示的3个杂交组合中，‘矮粉1号ב花王和‘凤凰涅槃ב花王组合均属于受精前障碍，而‘凤凰涅槃ב层中笑则属于双重障碍。针对不同原因造成的杂交结实特性弱的问题，今后在开展相关杂交时可以有意识地采用相应措施予以预防，如针对受精后障碍，可采取幼胚拯救培养法，而针对受精前障碍，则可尝试柱头切割、花粉蒙导等方法。

参考文献：

[1] 李嘉珏.中国牡丹与芍药[M].北京：中国林业出版社，1999： 10-20.

[2] James W W.Improbable peonies[J].Horticulture，2003，100（2）： 44-49.

[3] 宋春花. 芍药杂交亲和性的细胞学研究[D].泰安：山东农业大学，2011.

[4] 侯祥云，郭先锋. 芍药属杂交育种研究进展[J]. 园艺学报，2013，40 （9）： 1805-1812.

[5] 何桂梅，孙菊芳，成仿云.牡丹芍药组间杂交种的起源及其发展[J].北方园艺，2006（6）： 106-108.

[6] 张栋. 牡丹远缘杂交及部分杂交后代的AFLP分子标记鉴定[D].北京：北京林业大学，2008.

[7] 王越岚. 牡丹的杂交育种及组间杂种育性的研究[D].北京：北京林业大学，2009.

[8] 郝津藜，董晓晓，袁涛.四种药剂柱头处理对芍药属远缘杂交授粉结实率的影响[J].中国农业大学学报，2019，24（1）： 40-45.

[9] 郭大龙.牡丹种质资源遗传多样性研究进展[J].北方园艺，2007（9）： 61-65.

[10]黎裕，王建康，邱丽娟，等.中国作物分子育种现状与发展前景[J].作物学报，2010，36（9）： 1425-1430.

[11]王历慧，郑黎文，于晓南.中西方芍药切花应用与市场趋势分析[J].黑龙江农业科学，2011（2）： 147-150.

[12]孙晓梅，辛如洁，董召阳，等.芍药品种间杂交亲和性及种子破眠方法研究[J].西北农业学报，2019，28（5）： 1-6.

[13]朱惜晨，王静，静恒，等.芍药花粉生活力测定与杂交亲本选择初步研究[J].福建林业科技，2007（2）： 121-123.

[14]郝青，刘政安，舒庆艳，等.中国首例芍药牡丹远缘杂交种的发现及鉴定[J].园艺学报，2008， 35（6）：853-858.

[15]韩欣. 牡丹杂交亲本选择及F1代遗传表现[D].北京：北京林业大学，2014.

[16]苏美和. 牡丹育种技术及杂交一代遗传多样性的研究[D].泰安：山东农业大学，2013.

[17]秦魁杰， 李嘉珏.芍药[M].上海：上海科学技术出版社， 2000： 1-3.

[18]刘建鑫，于晓南.芍药与牡丹远缘杂交花粉萌发与花粉管生长行为观察[J].北京林业大学学报，2016，38（9）：80-86.

[19]贺丹，王雪玲，高晓峰，等.牡丹芍药远缘杂交亲和性[J].东北林业大学学报，2014，42（7）： 65-68.