一种细胞内快速标记邻近蛋白复合物的新方法

2020-07-03 00:47戴大鹏蔡剑平
医学研究杂志 2020年5期
关键词:生物素强力霉素

刘 健 周 姗 戴大鹏 蔡剑平

生物体功能的实现需要蛋白质的参与,其中多数生物学功能的行使必须借助于多种蛋白质间相互配合,组成蛋白质复合物来实现。研究蛋白质间的相互作用及定位组成可以更好地理解相关蛋白质的功能和细胞内外复杂的信号转导网络。近年来,邻近蛋白质标记方法(protein-proximity labeling)被越来越广泛地应用于解析细胞内蛋白复合物的组成[1, 2]。该方法通过应用一种可以混杂标记的酶与目的蛋白融合表达,再添加特定底物,比如生物素,进而使得该酶可以在体内(in vivo)共价催化纳米级别范围内的相关内源性蛋白。已有的邻近标记方法主要分为两大类:一类是以生物素连接酶为基础,如BioID、BioID2、BASU等[3];另一类以过氧化物酶为基础,如APEX 和APEX2。BioID和 APEX2是目前应用最为广泛的邻近蛋白质标记方法,二者各自有其独特的优势。BioID标记方法虽然简单且无毒,只需加入生物素来起始标记过程,但其生物素标记反应时间较长,需要18~24h,无法捕捉瞬时或作用力较弱的蛋白复合物。与之相反,APEX2反应速度较BioID迅速,适用范围广,但其标记过程需要对样品进行H2O2处理,导致有些样品因其毒性作用而无法适用,同时氧化处理也可能会改变细胞内微环境,从而破坏某些蛋白与蛋白间的相互作用。

为弥补现有邻近蛋白标记方法的不足,2018年Alice YTing领导的科研小组通过对BirA*进行酵母展示技术定向突变,获得了一种生物素标记时间显著降低的生物素连接酶——TurboID, 该酶在相同条件下仅需用生物素处理短短10min即可获得与传统BioID类似甚至更高的标记效率,彻底解决了限制BioID系统应用的最主要技术瓶颈[4]。本研究率先在国内重建了TurboID系统,并将其置于Tet-on系统的调控之下,以精确调控目的蛋白的表达量,随后将所有表达单元插入改造后的慢病毒载体,借以大大拓展该系统的细胞适用范围。

材料与方法

1.材料:HeLa细胞及293T细胞购自美国ATCC公司。慢病毒载体Lenti-Cas9-Blast、PSPAX2及PMD2.G购自美国Addgene公司。转染试剂Lipofectamine 3000、杀稻瘟菌素、蛋白酶抑制剂(halt protease inhibitor cocktail, EDTA-free)购自美国Thermo Scientific公司。强力霉素、Hoechst 33258、生物素、碳酸氢铵、Triton X-100购自美国Sigma公司。Streptavidin-HRP 购自英国Abcam公司。兔抗人YB1单克隆抗体(D2B12)购自美国Cell Signaling Technology公司。兔抗人GAPDH单克隆抗体购自上海Abmart公司。限制性内切酶、DNA ligation kit Ver 2.1、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase高保真酶购自日本TaKaRa公司。切胶纯化及PCR产物纯化试剂盒购自美国Omega公司。

2.基因及引物合成:北京博迈德公司合成载体构建用引物(表1)及含TurboID编码区的插入片段。该插入片段由多克隆位点MCS(包含BsrGⅠ、BstBⅠ、AgeⅠ、BSu36Ⅰ、SfiⅠ、XhoⅠ、PacI酶切位点)、TurboID、HA标签序列、Tet-on系统(含Tight启动子、PGK启动子、杀稻瘟菌素抗性基因BSD、P2A序列及rtTA)组成,5′及3′末端分别加入KpnⅠ及EcoRⅠ酶切位点(图1)[4~6]。

表1 载体构建用引物列表

下划线所示为括号内的酶切位点

图1 Lenti-TurboID载体的构建路径

3.Lenti-TurboID质粒载体构建:37℃下使用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切Lenti-Cas9-Blast质粒,2%琼脂糖凝胶电泳后回收7.5kb的片段lenti-NR。KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切含TurboID编码区的合成片段,并与酶切的lenti-NR连接,获得慢病毒质粒载体命名为Lenti-TurboID (图1)。送北京天一辉远生物技术公司使用表1中列出的测序引物进行测序分析,以确保插入的合成基因序列完全正确。

4.TurboID-YB1及TurboID-GFP融合表达载体的构建:以人YB1 cDNA全长质粒克隆及pEGFP-C1载体(美国Clontech公司)为模板,使用表1中列出的扩增引物,利用PrimeSTAR®Max DNA Polymerase高保真酶分别扩增YB1及GFP的开放阅读框编码区,同时加入预设酶切位点。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后,紫外灯下切取YB1及GFP目的条带并使用切胶纯化试剂盒纯化产物,回收产物分别使用BstBⅠ/Bsu36Ⅰ或AgeⅠ/Bsu36Ⅰ 37℃下酶切1.5~2.0h,产物纯化后与经同样双酶切的Lenti-TurboID载体连接,获得融合表达载体TurboID-YB1及TurboID-GFP。

5.慢病毒包装及侵染:6孔板内种植4×105个293T细胞,次日参照Lipofectamine 3000说明书转染TurboID-YB1、TurboID-GFP及辅助质粒PSPAX2及PMD2.G,培养48h后收集含病毒培养基并使用0.45μm滤膜过滤后用于后续侵染。取适量病毒加入到融合度为50%的HeLa细胞中,培养24h后重悬细胞于含2μg/ml杀稻瘟菌素的DMEM高糖培养基中筛选培养14天,期间每隔2天更换1次新鲜培养基。

6.强力霉素诱导浓度筛选:6孔板内种植3×105个第5步获得的融合表达TruboID-YB1的HeLa细胞,次日更换新鲜培养基并加入强力霉素,使其终浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1.0和1.5μg/ml。继续培养24h后使用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞,取30μg细胞裂解物进行12% SDS-PAGE电泳。电泳产物利用湿转仪转至PVDF膜,使用5% 脱脂牛奶室温封闭60min,随后加入含兔抗人YB1 单克隆抗体(1∶1000的稀释比例)或兔抗人GAPDH单克隆抗体(1∶5000的稀释比例)的一抗反应液4℃振荡孵育过夜。次日TBST洗5次后加入含有山羊抗兔IgG-HRP(1∶4000)的二抗反应液室温振荡孵育1h。TBST洗3次后使用Millipore Immobilon Western试剂盒进行曝光显色,以检测融合蛋白的表达量。

7.GFP表达量的检测:24孔板内使用含10%小牛血清的DMEM培养基及添加0.5μg/ml强力霉素的培养基培养第5步获得的融合表达TruboID-GFP的HeLa细胞,培养24h后PBS洗涤1次,替换为4%的多聚甲醛溶液固定细胞5min,加入含10mg/L Hoechst 33258 的PBS溶液,室温染色10min, 倒置荧光显微镜下观察GFP的表达情况。

8.生物素标记时间筛选:使用含0.125μg/ml强力霉素的培养基培养细胞24h以诱导TruboID-GFP融合蛋白的表达,PBS洗涤细胞2次,使用含50μmol/L生物素的无血清DMEM培养基分别处理TurboID-GFP和TurboID-YB1两种细胞0、15、30、60和120min。PBS洗涤细胞2次,使用新鲜配制的裂解液[50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),8mol/L尿素,1mmol/L DTT,1×Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free]裂解细胞。取20μg细胞裂解物进行12% SDS-PAGE凝胶电泳,产物转至PVDF膜后使用BSA封闭液[PBS中含1%牛血清白蛋白,0.2% (w/v) Triton X-100]室温封闭30min。按照1∶40000稀释Streptavidin-HRP于BSA封闭液,4℃过夜孵育。在室温下PBS洗膜3次去除未结合的抗体,使用ABS封闭液[PBS中含10%牛血清白蛋白,1% (w/v) Triton X-100]封闭5min。PBS洗膜3次后,使用Millipore Immobilon Western试剂盒检测生物素标记的蛋白。

结 果

1.慢病毒载体的构建:参照图1的构建路线,经测序验证,获得的慢病毒表达载体TurboID-YB1及TurboID-GFP的序列完全正确。

2.强力霉素可有效诱导TurboID与目的蛋白在细胞内的融合表达:不添加诱导剂强力霉素,细胞内检测不到融合蛋白TurboID-YB1。随着强力霉素使用浓度的增加,融合蛋白TurboID-YB1在细胞中的表达量呈现出明显的递增关系,仅使用0.125μg/ml便可诱导目的蛋白YB1的表达,且其表达量与HeLa细胞内源性表达的YB1蛋白接近(图2)。

图2 不同剂量的强力霉素诱导融合蛋白TurboID-YB1在HeLa细胞内的表达

为进一步验证可诱导性这一特点,对照细胞(TurboID-GFP病毒侵染的HeLa细胞)进行了强力霉素诱导处理,结果显示,不添加强力霉素时几乎检测不到GFP的表达,添加0.5μg/ml强力霉素处理可显著提高目的蛋白GFP的表达(图3)。

图3 强力霉素可有效诱导对照细胞中GFP的表达绿色荧光,×200

3.TurboID系统可对目的蛋白及其邻近的蛋白分子有效标记生物素:使用50μmol/L的生物素处理融合表达TurboID-YB1的HeLa细胞,并使用Streptavidin-HRP进行Western blot法检测生物素标记的蛋白。处理15min后两类细胞系中均检测到了大量生物素标记的蛋白,同时随着孵育时间的延长,被标记蛋白的数量逐渐增多。将实验组细胞TurboID-YB1同对照组细胞TurboID-GFP中标记的蛋白进行对比后发现,实验组细胞中可标记更多种类的蛋白,尤其是在相对分子质量>35kDa范围内的条带种类明显较对照组增多(图4)。

图4 Western blot法检测携带生物素标记的蛋白箭头所指分别为融合表达的TurboID-GFP及TurboID-YB1蛋白

讨 论

为研究生物体内蛋白质与蛋白质之间的相互作用,人们先后发展出了生化分馏技术、酵母双杂交(yest two hybrid assay, Y2H)以及以免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)为代表的亲和纯化(affinity purification,AP)等研究方法,并在国际范围内得到了广泛应用。然而这些技术都存在一些固有缺陷:不容易捕捉瞬时或较弱的蛋白相互作用;需要过表达目的蛋白,因此并不能真实反映相关蛋白复合物在细胞内的真实情况;细胞裂解液往往会破坏目的蛋白在正常细胞内的真实分布等[2,6]。为弥补这些不足,以BioID和APEX为代表的邻近蛋白质标记方法应运而生,其中BioID技术因其细胞毒性小、标记效率高、适用性广等优点被大量采用。该技术于2012年被首次报道,至今已被超过100多篇研究用于解析细胞内的蛋白组成[6,7]。但该技术仍然存在一些限制因素,主要体现在标记时间过长(一般要>16h),且标记效率不高,因此无法捕获瞬时或相互之间结合力弱的蛋白质。为解决这些问题,先后衍生出了一系列改良型生物素连接酶,例如BioID2、BASU,但这些方法仍然无法从根本上解决这些问题[8,9]。Alice YTing科研团队报道了一种新的BirA突变体——TurboID,只需简单用生物素处理10min,便可获得与传统BioID类似甚至更高的生物素标记效率,彻底解决了制约BioID技术发展的瓶颈问题[4]。自首次报道以来短短1年时间内,已被多个研究团队成功应用于植物及酵母等多个物种[10,11]。

本研究中笔者成功构建了可以融合表达TurboID及目的蛋白的病毒载体系统。与之前的报道类似,仅对细胞做生物素处理15min以上,便可在HeLa细胞内检测到大量被生物素标记的蛋白质(图4)[4]。另一方面,相对于最初报道的TurboID系统,本系统具有两个突出的特点:(1)目的蛋白的表达量可以精确控制[4]:由于Tet-on系统的引入,TurboID及目的基因的融合表达完全受制于外加诱导剂——强力霉素浓度的高低,通过调整诱导剂的加入时间及使用浓度,可以精确控制目的基因的表达时间及表达量,获得更贴近于生物体原本状态的实验数据(图2)[5]。(2)细胞适用性更广:TurboID及传统的BioID多以质粒为载体,以293T细胞为研究对象,这主要是由于293T细胞具备质粒转染效率高、外源基因表达量高、细胞生长旺盛等特点。相对于质粒系统,笔者构建的病毒载体系统以lenti-cas9载体为基础,具备病毒包装效率高、细胞适用性广的优势,可产生高效价的病毒,并广泛应用于分裂或原代培养的细胞,而不仅仅局限于293T这一类细胞[12,13]。

综上所述, 本研究建立的TurboID体系提供了一种新型的探测蛋白质相互作用和空间关系的方法,该方法可以应用到多种细胞及多个物种,操作简便快速, 可精确控制目的蛋白的相对表达量,具有广阔的应用前景。

猜你喜欢
生物素强力霉素
通江县:砥砺奋进 强力构建“温暖人社”
外源性生物素对基于生物素-链霉亲和素化学发光技术干扰的研究进展
原核生物中生物素代谢调控因子研究进展
阿奇霉素在小儿百日咳的应用
D-生物素合成研究进展
生物素在养猪生产中的应用
桑叶中1-脱氧野尻霉素的抗病毒作用研究进展
70年扶贫开发 脱贫攻坚持续强力推进
基于西门子840Dsl系统的数控强力刮齿加工软件开发
“强力后勤”入职记