胡桃醌通过调节NF-κB/Snail通路抑制卵巢癌细胞上皮间质转化

鞠晓红，徐海月，李 强，陈 爽，方 芳 (吉林医药学院检验学院，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是常见的恶性生殖器肿瘤，极易发生侵袭转移，初诊时75%的患者已属于晚期[1]。上皮-间质转化(epithelial-to-esenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在正常生理和特定病理情况下向间质转化的现象，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得间质表型，使细胞获得较高的迁移与侵袭能力[2]。目前，临床针对卵巢癌的治疗主要采用手术治疗联合铂类化疗作为治疗手段，但是发生耐药是卵巢癌治疗失败的重要因素[3]。因此，寻找有效治疗卵巢癌的药物至关重要。胡桃醌是从核桃楸中提纯的一种天然成分，具有抗肿瘤的作用。前期研究结果表明，胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3细胞黏附和侵袭作用[3]，是否胡桃醌具有抑制卵巢癌细胞EMT的作用还不清楚。本研究利用胡桃醌作用卵巢癌细胞，明确胡桃醌对卵巢癌细胞的EMT作用，并探讨其作用机制，积极发现抑制卵巢癌细胞EMT的有效药物，对于提高卵巢癌的疗效十分重要。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

人卵巢癌SKOV3细胞购自上海中科院细胞库；胡桃醌(美国Sigma公司)；兔抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、Snail、NF-κB p65、β-actin和Histon H抗体和NF-κB通路抑制剂PDTC(美国Cell Signaling Technology公司)。细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)；Western blotting系统(美国BIO-RAD公司)；生物显微镜(日本Olympus公司)；凝胶成像系统(美国BioRad公司)。

1.2 细胞培养

将人卵巢癌细胞SKOV3细胞培养于含10%胎牛血清IMDM培养液中，隔日换液，选择生长状态良好的对数期细胞进行实验。

1.3 细胞划痕法检测细胞迁移率

细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞汇合率达80%左右时，用灭菌的200 μL枪头垂直均匀地划出1条笔直的无细胞的划痕；PBS洗2次，然后根据前期实验结果的IC50值选择加入20 μmol/L胡桃醌培养液[5]，以减少由于药物引起的细胞凋亡造成对实验的影响。同时设阴性对照孔，显微镜下记录位置并拍照，记该点为0 h。37 ℃，5%CO2条件下继续培养24 h；取出6孔细胞培养板，显微镜下原位点拍照，记该点为24 h。使用Image J软件分析每个图片无细胞区域面积，划痕闭合率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/(0 h划痕面积)×100%，重复3次。

1.4 免疫印迹法检测EMT相关蛋白及NF-κB-p65和Snail的表达

终浓度为20 μmol/L胡桃醌作用细胞24 h，加入细胞裂解液，用细胞刮器刮取细胞，4 ℃超声裂解细胞，分别提取细胞总蛋白和细胞核蛋白，收集上清液测蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE，并转移到PVDF膜上。室温下PVDF膜在封闭缓冲液中2 h，加兔抗E-cadherin、N-cadherin、NF-κB-p65、Snail抗体(1∶1000)、β-actin和Histon H抗体(1∶4000)4 ℃过夜。次日TBST洗膜，分别加HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶4000)，室温避光孵育2 h。TBST洗膜，加底物发光显影。使用Quantity One软件扫描并做灰度分析。

1.5 统计方法

应用SPSS17.0软件进行数据分析，组间差异比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 胡桃醌对SKOV3细胞迁移率影响

与对照组划痕闭合率(74.4±9.2)%比较，胡桃醌作用细胞后更少的细胞向划痕中央聚集，划痕闭合率为(40.6±4.7)%，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

阴性对照组 胡桃醌组

2.2 胡桃醌对SKOV3细胞EMT相关蛋白表达影响

结果显示，对照组和20 μmol/L胡桃醌作用细胞24 h后E-cadherin表达分别是(0.31±0.04)和(0.45±0.05)；N-cadherin表达分别是(0.44±0.03)和(0.22±0.02)。与对照组比较，胡桃醌组的E-cadherin表达升高(P<0.05)、N-cadherin表达降低(P<0.01)。

阴性对照组 胡桃醌组

图 2 胡桃醌对SKOV3细胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表达影响

2.3 胡桃醌通过NK-κB途径抑制SKOV3细胞EMT

Western blotting检测阴性对照组和胡桃醌组细胞NK-κB p65和Snail的表达。结果表明，阴性对照组的NF-κB p65和Snail的表达分别是(0.84±0.04)和(0.43±0.03)；胡桃醌组NF-κB p65和Snail的表达分别是(0.57±0.02)和(0.21±0.03)。与阴性对照组比较，胡桃醌组的NF-κB p65和Snail的表达下降(P<0.05，P<0.01)(图3)。表明胡桃醌可能通过NF-κB信号途径抑制SKOV3细胞的EMT作用。

为了进一步证实NF-κB信号通路参与胡桃醌抑制SKOV3细胞的EMT作用，NF-κB途径抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯10 μmol/L(PDTC)与胡桃醌作用，Western blotting检测Sanil的表达。结果显示，与胡桃醌组Snail蛋白表达(0.62±0.02)比较，胡桃醌与PDTC联合作用细胞后Snail蛋白表达(0.1±0.01)下降(P<0.01)(图4)。

阴性对照组 胡桃醌组

图 3 胡桃醌对SKOV3细胞NF-κB p65和Snail蛋白表达影响

图 4 PDTC促进胡桃醌抑制Snail蛋白表达

3 讨 论

肿瘤转移是复杂过程。其中，肿瘤细胞脱离原发病灶并获得侵袭能力是肿瘤转移的第一环节。EMT是指上皮细胞向间质转化的现象。间质表型能增加细胞迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。EMT的发生伴随上皮标志物E-cadherin、紧密连接蛋白ZO-1、β-连环素等表达下调；间质标志物波形蛋白、N-cadherin等表达上调。其中E-cadherin的表达下降在EMT的发生中至关重要[6]。胡桃醌是从核桃楸中提纯的一种天然成分，具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的功能[7-8]。本研究结果表明，胡桃醌作用卵巢癌SKOV3细胞可以抑制细胞迁移、使E-cadherin表达升高而N-cadherin表达下降的作用,表明胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3细胞EMT的作用。

EMT的调控机制复杂，多种生长因子、转录因子和信号通路参与EMT的调节，其中Snail是重要调节EMT的转录因子。Snail可以结合到E-cadherin基因的启动子近端部位的E-box序列，进而抑制其表达水平，从而导致EMT现象的发生[9]。NF-κB作为转录因子与肿瘤的发生、生长和转移等多个过程密切相关。P65是NF-κB一个亚基，其激活后由细胞质进入细胞核，具有促进细胞增殖和抑制凋亡等作用[10]。NF-κB信号通路是卵巢癌细胞促进化疗耐药、肿瘤细胞转移和免疫逃逸的主要掌控者[11]。Snail作为重要的EMT转录因子可以被NF-κB调节。NF-κB可以作用在Snail的启动子区增加Snail的转录[12]。本研究结果表明，胡桃醌能够抑制SKOV3细胞NF-κB p65和Snail表达。

为了进一步验证胡桃醌通过NF-κB途径抑制卵巢癌细胞EMT的作用，研究使用了NF-κB途径激活剂PDTC处理SKOV3细胞。结果发现，PDTC能够进一步抑制Snail蛋白的表达。

综上所述，本研究发现胡桃醌可能通过抑制NF-κB/Snail信号通路降低卵巢癌细胞EMT的发生，从而减少卵巢癌细胞侵袭。本研究明确胡桃醌抑制卵巢癌细胞侵袭转移作用，为卵巢癌的临床研究和治疗提供一定的理论基础。