复方五味子口服液的制备及抗疲劳功能评价

孙靖辉，李 薇，李正祎，王春梅，李 贺，陈建光*

(1.北华大学药理教研室，吉林 吉林 132013;2.北华大学2016级药学研究生班，吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院临床检验基础教研室，吉林 吉林 132013)

随着当今社会生活方式的改变，人们压力逐渐增加，疲劳成为我们值得注意的一个问题。如果人体长期处于疲劳状态，会产生反应迟钝、注意力减退和记忆力下降等症状，严重影响生活的质量，甚至产生病理性危害。因此，迫切需要开发安全、有效、可长期服用的功能食品来延缓疲劳[1]。

中药是我国历代医家和劳动人民在长期的积累和探索过程中逐步发现而沿用至今的，是以我国特有的中医理论为指导的药物分支，其安全、低毒、疗效肯定等特性使很多中药品种成为“药食同源”的范畴。本课题组依据中医组方理论，选取五味子、黄芪和覆盆子为原料，经现代提取制备技术配制成复方五味子口服液，该配方药物组成及提取工艺已获得国家发明专利[2]。本研究通过单因素正交实验优化提取工艺，制成复方五味子口服液，并通过动物实验对其抗疲劳作用进行功效学验证，为其临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

2.1 实验材料

五味子由吉林省集安市五味子种植基地提供，黄芪和覆盆子购自于安图市安兴中药饮片有限公司，以上药材均由北华大学药学院生药教研室王维副教授鉴定为真品；葡萄糖(广州化学试剂厂)；辅料蔗糖、苯酚、山梨酸钾、浓硫酸(天津市福晨化学试剂厂)；肝糖原测试盒、乳酸测试盒、血清尿素氮测试盒(南京建成生物工程研究所)。旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；药品粉碎机(江阴宝利JB-450)；Infinite M200酶标仪(瑞士Tecan公司)。

SPF级雄性ICR小鼠200只，平均分为4批分别进行以下实验，体重(20±2)g，由长春亿斯实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(吉)2016-0003。

2.2 复方五味子口服液的制备

取五味子、黄芪、覆盆子(1∶5∶3)，置提取罐中，加入40倍量蒸馏水(90 ℃)，浸泡30 min，水煎煮3 h，200目过滤，重复3次，合并3次滤液。提取液减压浓缩，放置室温后，加95%乙醇至含醇量70%，搅匀后常温静置24 h，过滤，得醇溶液。减压回收乙醇，加适量纯化水至总量的70%，4 ℃静置24 h，过滤，得滤液。糖浆配制：取蔗糖加适量纯化水，煮沸，搅拌溶解，趁热过滤，添加适量热水，搅匀，得约80%糖浆，过微滤膜，孔径0.5 μm，压力0.3 MPa。得到复方五味子口服液。

2.3 复方五味子口服液的提取工艺优化

2.3.1单因素及正交试验

本研究通过4个关键单因素对多糖提取工艺进行优化，即料液比A(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、提取时间B(1、2、3、4、5 h)、提取温度C(60、70、80、90、100 ℃)和提取次数D(1、2、3、4、5次)，以这4个为单因素条件分别做试验。

以单因素实验为基础，选择料液比、提取时间、提取温度、提取次数(A、B、C、D)4个因素进行L9(34)正交试验设计，详见表1。

2.3.2苯酚硫酸法进行多糖含量测定

精密称取无水D-葡萄糖对照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，得对照品溶液(0.1 g/L)。吸取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL分别加入25 mL比色管中，补水至2 mL，摇匀。依次加入5 mL浓硫酸，1 mL 6%苯酚，振荡后，室温放置15 min，在最大吸收波长490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线方程，计算多糖得率。

表 1 正交试验因素水平表

2.4 复方五味子口服液的抗疲劳作用

2.4.1负重游泳实验

取小鼠48只(第1批)，分为4组，分别为对照组，复方五味子口服液低、中、高(SAR-L、M、H)剂量组(给药量为0.015、0.03、0.06 mL/kg，灌胃前将各组给药液体量统一稀释为0.02 mL/g)。SAR各剂量组给予相应SAR溶液15 d，对照组给予同体积蒸馏水，在最后一次给药后30 min，将小鼠单独放入泳箱内中(水深>30 cm，温度25 ℃±1 ℃)。在每只小鼠的尾根上装载铅皮(体重的5%)，记录小鼠自游泳开始至力竭的时间(力竭标准为小鼠沉入水面以下10 s不能浮出)。

2.4.2血清尿素氮测定

取小鼠48只(第2批)，分组及给药剂量如2.4.1，在最后一次给药后30 min，不负重游泳(水温30 ℃)90 min，休息60 min后采血，分离血清，运用试剂盒测量血清尿素氮的含量。

2.4.3肝糖原测定

取小鼠48只(第3批)，分组及给药剂量如2.4.1，在最后一次给药后30 min，不负重游泳(水温30 ℃)90 min后立即处死，取肝脏，运用试剂盒测定肝糖原含量。

2.4.4乳酸测定

取小鼠48只(第4批)，分组及给药剂量如2.4.1，在最后一次给药后30 min，采血20 μL，然后不负重游泳(水温30 ℃)10 min后，采血20 μL，试剂盒测定乳酸含量，并计算游泳前后乳酸升高百分比。

2 结 果

2.1 复方五味子口服液的制备工艺研究

2.1.1标准曲线的绘制

以不同浓度的葡萄糖对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，计算出浓度和吸光值之间的线性关系。回归方程为Y=2.127 4x+0.009 9，R2=0.999 7，用于进行多糖含量的计算。

2.1.2单因素实验结果

实验结果显示，当料液(g∶mL)比为1∶30时，多糖得率达到最大值，故选择1∶20、1∶30、1∶40作为下一步的正交试验的因素水平；多糖得率在提取时间为4 h时最大，所以选择3、4、5 h作为正交试验的因素水平；提取液中多糖的含量随着温度的升高而升高，提取温度大于80 ℃后多糖得率升高变缓，选择70、80、90 ℃作为正交实验的因数水平；提取次数为3次时，多糖得率最高，选择2次、3次、4次作为正交试验的因素水平。

2.1.3正交试验结果

根据表2中正交试验结果及极差分析可知(A:料液比，B:提取时间，C:提取温度，D:提取次数)，因素A中k2>k3>k1，因素B中k1>k3>k2,因素C中k3>k1>k2,因素D中k2>k3>k1,但R值A>C>D>B，可知各因素对提取液中多糖的影响由大到小依次为料液比、提取温度、提取次数、提取时间。最佳因素的水平组合为A3B1C3D2，即料液比1∶40，提取时间3 h，提取温度90 ℃，提取次数3次。总多糖平均含量为20.84%。

表 2 正交试验结果

2.2 复方五味子口服液对小鼠力竭游泳时间、血清尿素氮、肝糖原和乳酸的影响

如图1所示，与对照组小鼠相比较，复方五味子口服液各剂量组均能够明显增加小鼠竭力游泳时间增加(P<0.05或P<0.01)和肝糖原含量(P<0.05或P<0.01)，并能显著降低小鼠血清尿素氮水平(P<0.05或P<0.01)和血清乳酸生成百分比(P<0.05或P<0.01)。

与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

图 1 复方五味子口服液对小鼠力竭游泳时间(A)、血清尿素氮(B)、肝糖原(C)和乳酸(D)的影响

3 讨 论

抗疲劳效果可通过运动耐量的增加去测量。强迫游泳运动是最常用的行为动物模型之一，已被广泛用于评估新化合物的抗疲劳特性[3]。血清尿素氮是蛋白质代谢的终产物，也是体内蛋白质代谢的指标。在休息时，血清尿素氮的产生和排泄处于平衡状态，而在竭力游泳后，血清尿素氮明显增加[4]。体内尿素氮与运动耐量之间存在正相关关系[5]。乳酸是厌氧条件下碳水化合物的糖酵解产物，糖酵解是在短时间内进行剧烈运动的主要能量来源[6]。许多研究表明，游泳到疲惫导致血乳酸水平显著升高，乳酸在血液中积聚的速度与游泳时间成反比关系[7]。肝糖原耗竭可能是疲劳发展的重要因素，因为运动过程中肝糖原耗尽，无法维持血糖水平，随之而来的低血糖可导致神经功能受损[8]。因此，糖原储存直接影响运动能力和增加糖原储存,有助于提高耐力和运动能力[9]。

近年来，大量研究表明了五味子[10]、黄芪[11]和覆盆子[12]的抗疲劳作用。而从中医药理论来看，五味子补肺益气，黄芪健脾助阳，覆盆子滋肾填精，三者通过调理肺、脾、肾三脏，达到气、血、精三者协同共补，共同发挥抗疲劳的作用。因此本课题组以五味子、黄芪和覆盆子为原料，选用人们最愿意接受的口服液制剂形式，制成复方五味子口服液。经过单因素及正交试验确定最优提取方法为料液比1∶40、提取时间3 h、提取温度90 ℃、提取次数3次，制成的口服液澄清透明、状态均匀、口感酸甜。通过动物实验证实其可以提高小鼠的负重游泳时间和体内肝糖原的含量，降低血清尿素氮和血乳酸的水平，有助于提高小鼠的运动能力和运动后的恢复，是一种值得推荐并具有广阔发展前景的功能保健食品。