番石榴叶提取物对db/db小鼠骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信号通路的影响*

梁 凡,苏 通,刘铜华,高 明,盛 彤,王 颖,郭翔宇△

1.首都医科大学附属复兴医院(北京 100038)；2.北京市西城区月坛社区卫生服务中心(北京 100038)；3.北京中医药大学东方医院(北京 100078)；4.北京中医药大学(北京 100029)；5.日本武库川女子大学药学部(日本兵库 6638179)

糖尿病已经成为对人类生命健康威胁最严重的疾病之一。据国际糖尿病联盟(IDF)发布的数据显示，目前有4.63亿成人糖尿病患者分布在世界各地，其中中国的成人糖尿病患者达到了1.164亿[1]。

番石榴叶是民间常用来治疗糖尿病的中药。前期研究发现番石榴叶提取物可以上调SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠骨骼肌的AMPK，进而激活下游胰岛素敏感的IRS-PI3K-AKT-GLUT4信号通路改善血糖[2]。本实验将进一步观察番石榴叶提取物对db/db小鼠的骨骼肌AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白和脂肪组织PGC-1α、UCP-1蛋白表达的影响，探讨其对骨骼肌和脂肪组织中糖代谢调节机制。

材料与方法

1 实验药物 番石榴叶提取物由北京中医药大学中药学院制备。

2 动物饲养 实验共纳入SPF级6周龄雄性肥胖的db/db(C57BLKS/J-m-Lepr-/-)小鼠24只以及同龄C57BL/6J雄性正常小鼠6只。所有小鼠均在北京中医药大学动物实验中心饲养，12 h/12 h自然昼夜光线照射，予普通饲料喂养，除每周检测空腹血糖前需要禁食不禁水12 h外，小鼠均自由进食、饮水。

3 主要试剂 血糖试剂盒购自Bayer公司，血浆胰岛素Elisa试剂盒购自Sigma公司。AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FDNC5、UCP-1的一抗均购自Abcam公司。二抗IgG/HRP购自CST公司。

4 分组与给药 所有小鼠适应性喂养2周，6只C57BL/6J小鼠设为正常组，db/db小鼠检测空腹血糖≥7 mmol/L视为造模成功，按体重查随机数字表将db/db小鼠分为四组：模型组、番石榴叶提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组6只小鼠。根据小鼠体表面积折算每日药物灌胃量，按低剂量组3.5 mg/kg(折算生药材2 g/kg)、中剂量组7 mg/kg(折算生药材4 g/kg)、高剂量组14 mg/kg(折算生药材8 g/kg)每日灌胃番石榴叶提取物，每日灌服模型组和正常组小鼠等量蒸馏水，所有小鼠每日灌胃1次，连续干预4周。

5 观察指标及检测方法

5.1 观察小鼠一般情况：实验研究期间每天观察小鼠体型、毛色、精神状态、活动量等一般情况，每周检测并记录一次进食量和体重变化。

5.2 空腹血糖：每周检测一次空腹血糖，采用快速血糖仪检测小鼠尾静脉末梢全血中的葡萄糖值，检测前禁食不禁水12 h。

5.3 处死、取材及检测生化指标：番石榴叶提取物干预4周后空腹脱臼处死所有小鼠，摘除眼球取血浆400 μl，-20℃冰箱保存血浆标本，采用Elisa血浆胰岛素试剂盒按制造商使用说明检测小鼠血浆胰岛素水平。皮下脂肪、后腿腓肠肌组织的取材在冰上进行，于-80 ℃冻存备用。

5.4 计算HOMA-IS和HOMA-IR：通过下面的公式计算胰岛素敏感指数(HOMA-IS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)评估胰岛素敏感性(FPG:mmol/L;FINS:μU/ml)：

5.5 Western-blot检测蛋白表达：采用Western-blot法检测骨骼肌中AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白的表达和脂肪组织中PGC-1α、UCP-1蛋白的表达。

结 果

1 番石榴叶提取物对db/db小鼠体重的影响 见表1。与正常组相比，模型组小鼠体型肥胖，体重明显升高；番石榴叶提取物高剂量组小鼠的体重较模型组小鼠明显下降，而中、低剂量组体重降低不明显。

表1 番石榴叶提取物对db/db小鼠体重的影响(g)

注：与模型组比较，*P<0.05

2 番石榴叶提取物对db/db小鼠空腹血糖的影响 见表2。模型组小鼠血糖明显升高；与模型组比较，db/db小鼠的血糖经番石榴叶提取物高剂量干预4周后显著降低。

表2 番石榴叶提取物对db/db小鼠空腹血糖的影响(mmol/L)

注：与模型组比较，*P<0.05

3 番石榴叶提取物对db/db小鼠血浆胰岛素(INS)的影响 见表3。与正常组相比，模型组小鼠胰岛素含量明显升高；番石榴叶提取物高、中剂量组小鼠胰岛素含量比模型组降低明显。

注：与模型组比较，*P<0.05

4 番石榴叶提取物对db/db小鼠胰岛素敏感指数(HOMA-IS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的影响 见表4。模型组小鼠胰岛素敏感指数明显降低，同时胰岛素抵抗指数明显升高；与模型组比较，番石榴叶提取物高、中剂量组小鼠胰岛素敏感指数明显升高，且番石榴叶提取物高、中、低剂量干预均使胰岛素抵抗指数显著降低。

表4 番石榴叶提取物对db/db小鼠胰岛素敏感指数和胰岛素抵抗指数的影响

注：与模型组比较，*P<0.05

5 Western-blot检测AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白在骨骼肌中的表达 见表5。各组小鼠骨骼肌AMPK-α蛋白表达经比较无明显差异；与正常组比较，模型组小鼠骨骼肌中p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表达显著降低；与模型组比较，番石榴叶提取物干预的小鼠p-AMPK-α、PGC-1α和FNDC5蛋白表达显著增加(图1)。

表5 番石榴叶提取物对db/db小鼠骨骼肌AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表达的影响

注：与模型组比较，*P<0.05

图1 番石榴叶提取物对db/db小鼠骨骼肌AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表达的影响

6 Western-blot检测PGC-1α和UCP-1蛋白在脂肪组织中的表达 见表6。模型组小鼠脂肪组织中PGC-1α、UCP-1蛋白的表达较正常组均显著降低；而在番石榴叶提取物干预的小鼠的脂肪组织中，PGC-1α和UCP-1蛋白表达均明显升高(图2)。

表6 番石榴叶提取物对db/db小鼠脂肪组织PGC-1α、UCP-1蛋白表达的影响

注：与模型组比较，*P<0.05

图2 番石榴叶提取物对db/db小鼠脂肪组织PGC-1α、UCP-1蛋白表达的影响

讨 论

白色脂肪组织棕色化是骨骼肌调控糖脂代谢的关键环节。哺乳动物体内的脂肪组织主要分为白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)。WAT的主要功能是储存能量，并分泌瘦素、脂联素等促炎细胞因子[3]；BAT则主要通过产热参与基础代谢和应激能量消耗[4]。BAT虽然仅占体重的1%，但在寒冷、药物、细胞因子等作用下可由WAT分化而来[5-6]。这个过程可由骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信号通路介导。单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员[7]，广泛存在于骨骼肌细胞中，它通过与一氧化氮(NO)相互作用，诱导骨骼肌细胞内的线粒体合成过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)辅助活化因子1α(PGC-1α)[8]，PGC-1α通过直接作用于骨骼肌膜蛋白FNDC5来提高其表达并促进它的修饰。Irisin是FNDC5修剪和修饰后的下游产物，被发现可以有效促进白色脂肪组织向棕色脂肪组织分化并以热能的形式消耗化学能[9]，动物实验[10]也已证实它可以有效降低体重和改善胰岛素抵抗。

番石榴叶是民间常用的降糖中药[11]，研究表明，番石榴叶中含有黄酮类和三萜类化合物等化学成分，可以显著降低血糖[12]。在前期研究中，本课题组发现番石榴叶提取物可上调SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠骨骼肌AMPK，进而激活下游胰岛素敏感的IRS-PI3K-AKT信号通路，促进GLUT4转运改善血糖。

db/db小鼠出生4周后便开始出现肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等一系列糖尿病症状[13]。结果表明，经过番石榴叶提取物4周的干预后，与模型组相比，高剂量组小鼠的体重、血糖明显降低，中剂量组小鼠的血糖在第2周时也有明显下降，高、中剂量组小鼠胰岛素水平均显著降低，胰岛素敏感性增强。在机制研究中，番石榴叶干预后的小鼠骨骼肌p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表达和脂肪PGC-1α、UCP-1蛋白表达表达均显著提高，磷酸化AMPK-α刺激下游PGC-1α-FNDC5信号通路被激活，使FNDC5下游产物Irisin分泌增多，Irisin通过循环系统与白色脂肪细胞上的特异性受体结合后，诱导BAT的分化并抑制WAT的形成，刺激DAT的线粒体上特有的解偶联蛋白-1提高表达。UCP-1对棕色脂肪的产热功能主要通过提高线粒体电子转运率来大量产热和消耗化学能[14]，最终降低体重和血糖。因此，番石榴叶提取物增强骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信号通路传导是其降低体重和血糖的途径之一。