NRF-1 基因敲除增加CoCl2 诱导的NRK-52E 细胞凋亡

董 飞， 孙红丽， 牛 楠， 李 卉， 赵 瑞， 王 婵， 赵 巍，2

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学医学科学技术研究中心，银川 750004）

急性肾损伤是以肾小球滤过功能下降为特征的常见临床综合征，产生的原因很多，如急性氧化应激、细胞缺血缺氧、毒素成分暴露、炎症及急性败血症等[1]，均可直接导致急性肾损伤，且患者发病率和死亡率相对较高。其中，缺血缺氧是导致急性肾损伤的主要原因之一[2]，并且在临床报道中日益增多。研究结果显示，短暂、急剧的急性缺氧代谢反应，会直接造成人的肾小管细胞上皮实质细胞大量凋亡的情况发生，可能导致人的肾小管实质上皮细胞数量减少，最终影响人的肾功能[3]。核呼吸诱导因子-1（nuclearrespiratoryfactor-1，NRF-1）在细胞表达功能调控中具有重要调控作用。此外，NRF-1 还可能具有更广泛的氧化作用，如在抑制血红素酶和生物碱的合成、细胞功能凋亡、氧化应激以及细胞代谢等诸多方面都可能具有一定的氧化参与抑制作用[4-5]，但目前关于NRF-1 与细胞缺氧所致的急性肾细胞功能凋亡的一些相关医学研究还尚未见明确报道。随着我国分子生物学相关技术的发展，CRISPR/Cas9 基因编辑相关技术已广泛遍布至全球各医学实验室，因其自身具有技术设计灵活、简易、可同时一次进行多少个靶点的基因编辑等优点，被广泛应用于分子生物、医学、农业等多个研究领域[6-8]。本课题研究项目拟通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术分析构建NRF-1 基因敲除的大鼠肾组织细胞，观察缺氧所致的凋亡反应发生时，NRF-1 对大鼠肾组织细胞基因凋亡功能水平的直接影响，初步分析探讨上述两者之间的相互关系，为大鼠肾损伤的基因治疗研究提供一个可能的研究方向。

1 材料与方法

1.1 主要细胞及试剂

HEK-293FT 细胞由本中心实验室管理保存，大鼠肾细胞NRK-52E 购自上海中国科学院生物细胞生物库。lenti-crispr 中的载体购于Addgene（#49535），载体结构图谱如图1 所示；T7核酸内切酶1（T7E1）、BsmBI 酶、T4 连接酶（NEB 公司）；DNA 提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；AnnexinV/FITC 凋亡检测试剂盒（BD 公司）；BCA 蛋白检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Bax、Bcl-2、caspas-3、Cleaved-caspase-3、HIF-1a 单克隆抗体和β-actin-HRP 单克隆抗体（abcam 公司）；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 主要仪器

小型台式离心机、二氧化碳培养箱（美国Thermo 公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）；电转仪、PCR 扩增仪、电泳凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD 公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 NRF-1-sgRNA 的构建 使用CRISPR 在线工具（http：//crispr.mit.edu）在NRF-1 基因第一个外显子处筛选敲除NRF-1 基因的靶点序列。选取其中得分最高的两个NRF-1-sgRNA 位点作为NRF-1 基因的敲除靶点，并在互补的两个NRF-1-sgRNA 链上分别加上与BsmBI 酶切位点基因互补的碱基。合成两种互补的sgRNAs 通过上海生物工程股份有限公司完成。

1.3.2 CRISPR/Cas9 质粒酶切 在37 ℃条件下用限制性核酸内切酶BsmBI 酶切lentiCRISPR质粒4 h，用1%琼脂糖凝胶电泳进行酶切分析，使用DNA 纯化回收试剂盒把分子量为11450 bp的线性质粒DNA 回收。

1.3.3 lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA 克隆及鉴定 将合成的互补的单链NRF-1-sgRNA 梯度退火形成双链，按照95 ℃5 min、95 ℃～85 ℃，-2 ℃/s、25 ℃5 min、16 ℃5 min、4 ℃保存的过程进行。在16 ℃条件下用T4 连接酶将胶纯化回收的线性化载体lentiCRISPR 与稀释100 倍后的双链DNA 按照3∶2 的比例连接12 h；将连接产物转化至感受态细胞DH5α，接种于含Amp 的LB 固体培养板，37 ℃恒温培养12 h；把阳性克隆扩大培养，通过测序验证其插入sgRNA 的序列是否正确。测序由上海生物工程股份有限公司完成。

1.3.4 慢病毒包装 将293FT 细胞培养至10 cm培养器皿中，待其完全汇合度为80%时，弃去培养液，加入5 mL 新配的培养液。在3 个无菌的EP 管中分别加入500 μL DMEM，每一个管分别加入6 μg plp1、6 μg plp2 和6 μg plpvs，随后分别加6 μg lentiCRISPR-sg1 和6 μg lentiCRISPRsg2，并以6 μg lentiCRISPR 为对照，涡旋震荡混匀；另外3 个无菌的EP 也在管中分别依次加入500 μL DMEM 上清培养液和40 μL polyJet 进行转化感染上清试剂，混匀后，立即将两个含少量polyjet 的上清混合液分别依次加入到3 个含质粒的上清混合液中，慢慢振荡混匀，室温下静置15 min，将其滴定后加至每个细胞上清中，混合均匀后将其放至细胞培养箱中再继续培养24 h，随后弃去上清培养液，加入10 mL 含10%胎牛血清的DMEM 完全培养液继续培养48 h，收集细胞上清，4 ℃，3000×g离心10 min。将细胞上清液在0.45 μm 的病毒细菌液过滤器中进行过滤后，50000×g离心2 h，丢弃上清，500 μL DMEM 培养液重悬病毒颗粒，于-80℃保存备用。

1.3.5 T7E1 酶切验证 按照5×105个/孔将NRK-52E 细胞接种到12 孔板后过夜培养。弃去培养液，将新配的DMEM 完全培养液加入1 mL，37 ℃继续培养1 h，首先每孔加入1 μL 聚凝胺（8mg·mL-1），然后分别加入5、10、15、20、25、30、35、40、45 和50 μL 的病毒液，同时以30 μL 空病毒作为阴性对照，慢慢混匀放入37 ℃培养箱培养48 h 后丢弃含病毒的培养液，分别加含嘌呤霉素的完全培养液（0.9 μg·μL-1）筛选阳性克隆；3 d 后将细胞通过流式单选法接种至96 孔板并扩大培养，取一部分细胞提取基因组DNA，PCR 扩增含敲除靶点的片段（上游引物:ATCAAATGCTAATCCCTG，下游引物:AACCACCGTCATAACACTA），产物大小为833 bp，将野生型与野生型PCR 产物、野生型与突变型PCR 产物、突变型与突变型PCR 产物变性退火形成杂交的DNA，T7E1 酶切30 min（37 ℃），用1%琼脂糖凝胶电泳挑选有效的敲除靶点。提取流式单选法扩大培养的lentiCRISPRNRF-1-sgRNA2 转染细胞的基因组DNA，PCR扩增包括敲除靶点的片段，将PCR 产物克隆至pClone007-vector 进行测序并通过生物信息学分析碱基的缺失情况。1.3.6 Western blot 验证NRK-52E 细胞中NRF-1 蛋白表达水平 将成功敲除并单选以后扩增的三株NRF-1 基因敲除的细胞分别命名为mutant1、mutant2、mutant3 细胞，分别将mutant1、mutant2、mutant3、空载体组（vector）和正常对照组（control）的细胞分别按照1×106个接种至6 cm细胞培养皿中，提取各组细胞中的总蛋白，测蛋白浓度。通过100 ℃10 min 使得蛋白变性，取30 μg进行电泳，电泳结束后用SD 半干转仪在电压20 V经过45 min 转至PVDF 膜上，0.2%PBST 封闭8h，4℃孵育一抗（NRF-1 1∶1000，β-actin 1∶50000）12 h，1% PBST 洗膜4 次，室温（25 ℃）孵育二抗（山羊抗兔IgG 1∶5000）1 h，洗膜4 次后曝光。使用Image Lab5.2 软件分析灰度值，用目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值计算蛋白相对表达量。

1.3.7 氯化钴（CoCl2）浓度对正常NRK-52E 细胞活性的影响 96 孔板每孔接种5×103个正常的NRK-52E 细胞后在5%CO2、37 ℃培养箱中过夜培养，加入CoCl2（终浓度为100、200、300、400、500、600、700 μmol·L-1）后37 ℃继续培养24 h，加入10 μL CCK-8 液继续培养1.5 h，450 nm 处测吸光度值后计算细胞活力，细胞活力计算公式：细胞活力（%）=（OD加药组-OD空白对照组）/（OD对照组-OD空白对照组）×100%。

1.3.8 Annexin V-FITC/PI 测定细胞凋亡情况 细胞按照1×106个接种至6 cm 培养皿中过夜培养，然后分别加入含CoCl2的完全培养液（终浓度为600 μmol·L-1）继续培养24 h，使用无Ca2+、EDTA的0.25%的胰酶消化细胞后用PBS 洗涤。然后取500 μL 细胞悬液分别加入5 μL Annexin V- FITC和5 μL PI，轻轻混匀后室温避光放置15 min，随后加入400 μL 1×Binding Buffer，用流式细胞仪器检测细胞凋亡率。

1.3.9 凋亡相关蛋白水平的检测 将NRF-1 敲除组（mutant3）、空载体组（vector）和正常对照组（control）细胞分别用含CoCl2的完全培养液（终浓度为600 μmol·L-1）培养24 h，首先提取总蛋白测定蛋白浓度，蛋白免疫印迹法（方法同1.3.6）检测各组细胞总蛋白中HIF-1a、Cleaved-caspase-3、Caspas-3、Bax、Bcl-2 和β-actin 的表达水平。抗体稀释倍数：HIF-1a、Cleaved-Caspase-3、caspase3、Bax、Bcl-2 均为1∶1000，β-actin 为1∶50000，山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 为1∶50000。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，采用GraphPad Prism 软件绘图。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lentiCRISPR-NRF-1-sgRNAs 的鉴定

构建慢病毒重组质粒lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA 并转化至感受态细胞，送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。测序结果表明，NRF-1-sgRNA1 及NRF-1-sgRNA2 正确插入到lentiCRISPR 质粒中（图2）。

2.2 sgRNA 活性的鉴定

2.2.1 T7EI 酶切验证 提取慢病毒转染细胞中的基因组DNA，PCR 扩增包含敲除靶点的片段（产物的大小为833 bp），把扩增的野生型与突变型PCR 产物、突变型与突变型PCR 产物、野生型与野生型PCR 产物退火形成杂交的DNA，T7EI酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳显示两个大小为469 bp 和364 bp 的DNA 片段，证明NRF-1基因的有效靶点是sgRNA2（图3）。

2.2.2 Sanger 测序 把lentiCRISPRsg-RNA2 转染细胞的基因组DNA 提取出来，PCR 扩增包含敲除靶点的片段，将PCR 产物克隆至pClone007-vector 上后转化至感受态细胞，送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序，把突变型细胞的测序结果与野生型细胞的测序结果进行比对，结果显示获得了1 个基因缺失的单克隆细胞株，与野生型的NRK-52E 细胞的测序结果比较，突变型单克隆细胞中缺失9 个碱基（图4）。

2.3 Western blot 验证NRK-52E 细胞中NRF-1蛋白表达水平

为验证碱基缺失的单克隆细胞株中NRF-1蛋白的表达水平，提取敲除组细胞株、空载体、正常细胞株的总蛋白，NRF-1 蛋白的表达水平通过Western blot 法检测（图5A）。与vector 组细胞株比 较，mutant1、mutant2、mutant3 各 组 细 胞 株 中NRF-1 蛋白表达水平降低（P＜0.01）（图5B）。我们将选取敲除效果最明显的mutant3 组细株作为后续实验的细胞株。

2.4 CoCl2 浓度对正常NRK-52E 细胞活性的影响

与正常培养的细胞比较，浓度为500、600、700 μmol·L-1的CoCl2均可降低细胞活性（P均＜0.05）（图6）。

2.5 Annexin V-FITC/PI 测定细胞凋亡情况

600 μmol·L-1的CoCl2刺激细胞后，mutant组（10.4±0.52）%细胞凋亡率高于control 组（4.7±0.21）%和vector 组（4.0±0.19）%（P均<0.01）（图7）。

2.6 凋亡相关蛋白水平的检测

与vector 组比较，mutant 组中缺氧诱导因子HIF-1a、凋亡蛋白Cleaved-caspase3、促凋亡分子Bax 表达水平均升高，抗凋亡分子Bcl-2 表达水平下降（P均<0.01）（图8）。

3 讨论

近年来，有关急性肾损伤发生时，肾细胞凋亡研究的报道越来越多[9]，而在引起急性肾损伤的众多原因中，缺血或非缺血肾组织缺氧是导致急性肾损伤的重要原因之一。CoCl2是目前国内外常用建立体外缺氧模型的缺氧诱导剂[10]。在CoCl2作用条件下，通过Co2+置换Fe2+从而影响氧的利用，进而抑制HIF-1α 降解，形成缺氧环境[11]。HIF-1α 是细胞在低氧条件下产生的蛋白性调节因子，能使机体产生低氧适应反应[12]。本实验结果显示，使用含CoCl2的完全培养液（终浓度为600 μmol·L-1）将NRF-1 基因敲除肾细胞、正常肾细胞及空载体肾细胞培养24 h 后，HIF-1a 增高。因此改善或者缓解缺氧条件下细胞凋亡从而改善急性肾损伤具有重要的意义。但是目前临床研究的治疗并不完善，因此基因治疗可能会成为临床上治疗急性肾损伤新的技术。

NRF-1 最初的研究是在关于细胞色素C 的研究中，并且目前关于其研究主要聚焦于对线粒体能量代谢的调控中，关于细胞凋亡的研究并不多。Zhang 等[13]研究发现，NRF-1 基因在山羊卵泡颗粒细胞（LGCs）的凋亡中发挥作用，通过流式细胞术发现，NRF-1 沉默的LGCs 的凋亡率显著增高。前期的研究中发现[14]，过表达大鼠心肌细胞H9C2 中的NRF-1 基因时，可使缺氧条件下细胞的凋亡水平降低。为了反向证明NRF-1 在肾细胞凋亡中是否也有这样的作用，本研究应用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，敲除NRK-52E 细胞的NRF-1 基因，研究其在CoCl2诱导时对NRK-52E 细胞凋亡的影响。结果显示，在CoCl2诱导缺氧条件下敲除组细胞凋亡率高于空载体组和正常对照组，进一步说明了NRF-1 在缺氧条件下的抗凋亡作用。

Bcl-2 和Bax 是线粒体PT 孔道的组成成分，细胞凋亡过程启动后，Bax 从胞浆中转移至线粒体膜上，介导PT 孔开放，凋亡相关物质经开放的通道转移至胞浆中[15-16]。Bcl-2 的抗凋亡作用是通过阻止cyt-c 的释放发挥作用。Caspase3 是细胞凋亡的执行者，正常情况下，细胞中的Caspase3 没有活性，当细胞凋亡被启动时，凋亡执行分子Caspase3 就会被激活，从而发生不可逆的凋亡过程[17]。本研究发现，NRK-52E 细胞中的NRF-1 基因敲除后，在缺氧条件下抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达水平上调，而促凋亡蛋白Bax 的表达水平下调，同时Cleaved-caspase3 的表达水平增高。以上结果说明，NRF-1 基因敲除增强了CoCl2诱导缺氧应激条件下NRK-52E 细胞凋亡水平。

综上所述，NRK-52E 细胞中的NRF-1 基因敲除后，可以增加CoCl2所致的缺氧条件下细胞的凋亡水平。揭示了NRF-1 基因可能的抗凋亡效应，为寻找治疗急性肾损伤的靶分子提供了可能的实验依据。