李一田, 王 璐, 崔瑞琴,2
(1.宁夏医科大学中医学院,银川 750004; 2.生育力保持教育部重点实验室,银川 750004)
雷公藤多苷(tripterygium wilfordii glycosides,GTW)是从雷公藤根芯部提取的一种脂溶性混合物,具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等功效。自1987年首次报道[1]GTW 可用于治疗儿童过敏性紫癜性肾炎(henoch-schonlein purpura nephritis,HSPN),经过30 多年的临床实践证实,GTW 具有确切的降低蛋白尿和血尿、消除水肿的作用[2-5]。但是,GTW 也引起一些严重不良反应的临床个案,其中生殖系统的不良反应更是引起广泛关注。因此,研究GTW 的损伤机制对临床安全用药具有重要意义。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)是中药枸杞的重要有效成分之一。LBP 具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、调节血糖、降血脂、抗辐射、神经保护、生殖系统保护等多种生物功效[6]。本课题组前期的实验结果已经证明,LBP 可通过上调大鼠睾丸组织中Bcl-2的表达来发挥促进GTW 所致生殖损伤的修复作用[7],而Bcl-2 是核因子-kB(nuclear factor-kappab,NF-kB)信号通路下游的重要靶点之一,具有抑制细胞凋亡的作用。因此,本实验是在前期研究基础上,基于NF-kB 信号通路进一步探索LBP 拮抗GTW 生殖损伤的机制。
雄性SD 大鼠30 只,3 周龄,体质量(60±10)g,SPF 级,购买自宁夏医科大学实验动物中心(许可证号:SCXK(宁)2015-0001)。SPF 级动物房饲养,温度(25±1)℃,湿度(50±10)%,自由进食、饮水。常规环境适应性饲养7 d 后开始实验。
雷公藤多苷片(GTW,规格10 mg/粒,100 粒/瓶,江苏美通制药有限公司,批号:Z32021007);LBP(95%浓度,宁夏宏德生物技术有限公司);羧甲基纤维素钠(CMC-Na,天津市凯通化学试剂有限公司);兔抗鼠p-p65、p65、Bcl-2、IKBα、βactin 及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(北京博奥森公司);全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)。
将3 周龄雄性SD 大鼠随机分为空白对照组(C 组,10 只),雷公藤多苷组(GTW 组,10 只)和枸杞多糖+雷公藤多苷组(LBP+GTW 组,10 只)。给药剂量依据临床实际用药量经计算后折算为等效剂量:大鼠剂量(mg)=6.3×成人剂量(mg)。C组给予0.5%浓度CMC-Na 液,灌胃给药,1 次/d,连续8 周;GTW 组灌服12.6 mg·kg-1的GTW 混悬液,灌胃给药,1 次/d,连续8 周;LBP+GTW 组灌服12.6 mg·kg-1GTW+160 mg·kg-1LBP,两种药液间隔2 h 灌胃给药,1 次/d,连续8 周。GTW 和LBP两种药液均用0.5%CMC-Na 溶液混悬。给药容积均为1 mL/100 g。末次给药2 h 后先称重,后用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射,麻醉后取睾丸,称湿重;一侧睾丸在两端扎眼,置于4%多聚甲醛液中固定,另一测睾丸置于-80 ℃冰箱保存。
1.4.1 脏器指数 脏器指数=单侧睾丸湿重/体质量。
1.4.2 组织病理 多聚甲醛中睾丸组织经固定48 h 后取出并流水冲洗2 h,按垂直睾丸长轴方向,切为2 个2~3 mm 厚的组织片,乙醇梯度脱水后二甲苯透明,石蜡包埋后于阴凉处过夜,次日将蜡块以8 μm 厚度切片置于47 ℃水展开,用载玻片捞片后以58 ℃烤片2 h。将切片进行常规HE 染色后,放于阴凉干燥处晾干,光学显微镜下观察并拍照。1.4.3 IKBα、p65、p-p65、Bcl-2 蛋白表达 从-80 ℃冰箱中取出睾丸,4 ℃匀浆并提取全蛋白,最后用BCA 方法进行蛋白定量。按照试剂盒说明严格操作:使用10% SDS-PAGE 分离胶电泳,4 ℃层析柜转膜;p-p65 使用2%浓度牛血清白蛋白(BSA)封闭,其他待测蛋白及内参选用5%脱脂奶粉封闭,时间均为2 h;稀释一抗及内参(稀释比例1∶400)后室温摇床孵育1 h,4 ℃摇床过夜;次日室温下复温1 h,TBST 洗膜5 min×4 次,再用HRP标记的二抗(稀释比例1∶4000)室温孵育1 h,TBST 洗膜5 min×4 次;之后ECL 曝光显色。用Image J 软件计算各组灰度值后与内参灰度值的比值。
采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t法检验,P≤0.05 为差异有统计学意义。
给药8 周后,GTW 组大鼠体质量、睾丸质量、脏器指数较C 组及LBP+GTW 组均降低(P<均0.05);而LBP+GTW 组体质量、睾丸质量以及脏器指数与C 组相比差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。
与C 组比较,GTW 组睾丸组织曲细精管水肿,曲细精管间距增宽,曲细精管腔生殖上皮变薄,甚至可见上皮细胞松散,间质细胞排列杂乱,精原细胞、精母细胞显著减少;LBP+GTW 组曲细精管间距增宽,但幅度低于GTW 组,精原细胞、精母细胞数量稍有减少,间质细胞排列尚可,曲细精管形态无明显差异。见图1~2。
表1 各组大鼠体质量、睾丸质量、脏器指数的比较(±s)
表1 各组大鼠体质量、睾丸质量、脏器指数的比较(±s)
与GTW 组比较*P<0.01,**P<0.05
组别 体质量/g 睾丸质量/g 脏器指数/%C 组 450.00±33.47* 1.82±0.06* 0.44±0.03*GTW 组 370.63±18.02 1.60±0.05 0.39±0.03 LBP+GTW 组 438.75±38.43* 1.78±0.04* 0.43±0.03**F 值 14.359 48.368 7.134 P 值 <0.001 <0.001 0.004
与C 组比较,GTW 组p65、p-p65 蛋白表达水平均升高(P均<0.01),IKBα、Bcl-2 蛋白表达水平均降低(P均<0.01);LBP+GTW 组p65、p-p65、Bcl-2 蛋白表达水平均升高(P均<0.01),IKBα蛋白表达水平降低(P<0.01)。LBP+GTW 组IKBα、p65、p-p65 及Bcl-2 蛋白表达水平均高于GTW 组(P均<0.01)。见图3、表2。
表2 各组IKBα、p65、p-p65、Bcl-2 与β-actin 灰度值比值的比较(±s)
表2 各组IKBα、p65、p-p65、Bcl-2 与β-actin 灰度值比值的比较(±s)
与C 组比较*P<0.01;与LBP+GTW 组比较#P<0.01
组别 IKBα p65 p-p65 Bcl-2 GTW 组 0.5022±0.0330*# 2.0649±0.0819*# 1.2155±0.0744*# 0.9567±0.0325*#LBP+GTW 组 0.6215±0.0152* 3.0524±0.1268* 1.3788±0.0453* 2.3295±0.0503*C 组 0.7360±0.0458 1.1494±0.0806 0.9456±0.0607 1.8060±0.0081 F 值 47.971 278.329 50.952 1577.237 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
雷公藤及其制剂的生殖损伤作用,在男性表现为精子细胞中酶的活性受到抑制,精子产生和成熟过程障碍,数量显著减少,活力降低,畸形率增加;在女性主要表现为月经紊乱,经量减少或闭经;雌二醇、孕酮水平降低,卵泡刺激素、促黄体生成素增高,甚至卵巢早衰、子宫萎缩[8]。本实验结果同样说明,GTW 可使大鼠睾丸质量和脏器指数降低,曲细精管水肿,管腔上皮变薄松散,精原细胞和精母细胞数量减少。《素问·上古天真论》曰:“女子七岁,肾气盛……八八,则齿发去。”人体生殖器官的生长发育,性机能的成熟与维持,都与肾紧密相关,肾精充,肾气沛,则精气溢泻,男女阴阳和合而有子,肾精、肾气不足,可导致男女生殖器发育不良和生殖能力衰弱,因此中医在治疗生殖系统疾病时尤为注重补肾填精。故本实验通过中药补肾的方法进一步研究GTW 减毒增效机制。
枸杞,又名枸杞子,药用部分是果实。性甘、平,归肝、肾经,可滋补肝肾,益精明目。《本草纲目》载:“枸杞,补肾生精,养肝明目,坚精骨,去疲劳,易颜色,变白,明目安神,令人长寿。”明代《摄生众秒方》所载五子衍宗丸是枸杞治疗肾虚精少的代表方剂,方中枸杞为君,发挥平补肝肾、填精补血功效。宁夏枸杞是道地药材,功效更佳,枸杞研发对道地药材的保护开发和宁夏的经济、民生都具有重要意义。作为枸杞重要有效成分之一的LBP 的组成包括中性糖(81.37%)、蛋白质(9.42%)和半乳糖醛酸(3.69%)。大量研究显示[9-11],LBP对雄性大鼠睾丸组织损伤及生殖细胞损伤具有明显的保护修复作用,表现为大鼠睾丸重量明显增加,睾丸组织形态恢复,精原干细胞增殖加快以及精子数量显著提高。本研究结果也发现,与GTW 组比较,LBP+GTW 组大鼠的体质量、睾丸质量均升高。病理结果显示,与C 组比较,GTW组的曲细精管扭曲、水肿;曲细精管间距增宽;精原细胞、精母细胞明显减少,而LBP+GTW 组的病理损伤明显轻于GTW 组。提示LBP 可以拮抗GTW 所导致的睾丸组织病理改变。
NF-kB 信号通路是体内一条非常经典的信号通路,参与细胞的生存、增殖和分化等相关基因的表达调控,在细胞凋亡的过程中发挥重要的作用[12]。Bcl-2 作为NF-kB 通路下游的重要靶点之一,是目前公认的细胞凋亡调控机制中的关键蛋白,是参与细胞凋亡的主要抑制基因,高表达的Bcl-2 蛋白可抑制细胞凋亡进程,延长细胞寿命。研究表明,在早孕期,NF-kB 信号通路可能被激活以此调节胚泡着床和妊娠期重要分子的表达;也可能被下调表达,发挥妊娠过程中的免疫抑制作用[13]。此外,刘辉等[14]发现:睾丸扭转复位诱导NF-kB 激活,之后进入生殖细胞核内调控Bax 表达水平、Bcl-2 表达水平降低,导致Bax 与Bcl-2 比值升高,从而引起生殖细胞的凋亡。提示NF-kB 信号通路与生殖功能存在密切关联性。因此本实验是基于NF-kB 信号通路所进行的实验研究。
NF-kB 蛋白通常以NF-kB/Rel 家族组成同源或异源复合物的形式存在,最常见的是p50/p65 异二聚体,也是其活性的主要形式。细胞在静息状态下,细胞质中的p50/p65 与其抑制物IkB结合成三聚体,使不能核易位。IkB 激酶主要由两个催化亚基IKKα、IKKβ 和一个调节亚基IKKγ组成。当细胞受到细胞外信号刺激时,IKKβ 亚基被磷酸化激活,继而引起IkBα 被磷酸化,磷酸化后的IkBα 降解,释放的p50/p65 进行核易位,与基因上的kB 位点发生特异性结合,从而发挥调节细胞功能的作用。因此,本实验通过Western blot检测IKBα、p65、p-p65 以及Bcl-2 蛋白表达,旨在从NF-kB 信号通路探讨LBP 拮抗GTW 生殖损伤的作用机制。本次实验结果表明,与C 组比较,GTW 组p65、p-p65 蛋白表达水平均升高,IKBα、Bcl-2 蛋白表达水平均降低;LBP+GTW 组p65、p-p65、Bcl-2 蛋白表达水平均升高,IKBα 蛋白表达水平降低。提示LBP+GTW 组和GTW 组大鼠睾丸中NF-kB 信号通路处于激活状态。LBP可能通过提高Bcl-2 的表达水平,以此拮抗GTW的生殖损伤作用。
综上所述,LBP 可以促进GTW 所导致的生殖损伤修复其作用机制可能是上调睾丸组织中p65、p-p65 以及Bcl-2 表达水平,激活NF-kB 信号通路来抑制该生殖损伤作用的发生。