超临界CO2萃取红麸杨果实中黄颜木素及其体外抗氧化活性研究

董爱文， 李维新， 王 欢， 邹亚珂

(吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000)

红麸杨(Rhuspunjabensisvar.sinicaRehd.)为漆树科盐肤木属落叶小乔木[1]，其根、茎、叶、皮、花和果实均可入药，且无需与其它中药配伍，单独使用效果就很好，具有祛风化湿、收敛解毒、生津润肺和降火化痰等功效[2]。黄颜木素(3，7，3，4-四羟基双氢黄酮)是具有多种生物活性与药用价值的黄酮类物质[3]。本课题组前期利用酶辅助提取协同大孔树脂纯化的方法，从红麸杨果实中提取分离纯化得到纯度68.15%的黄颜木素[4]。国内已有报道从盐肤木干燥心材粉末中获得的黄颜木素对人白血病K562细胞有较强的增殖抑制活性[5]；此外黄颜木素对肝癌Hep G2、肺癌A549和食管癌EC109这3种细胞株具有较强的增殖抑制活性[6]。国外也早已把黄颜木素作为防癌、防治心血管等疾病药物的主要药效成分和安全无毒新型氧化酶抑制剂而广泛的应用[7-10]。目前国内外研究者主要从豆科植物皂荚的皂角刺及松柏中提取黄颜木素[11]，而红麸杨果实中黄颜木素的提取分离只有本课题组报道了用酶辅助提取协同大孔树脂分离纯化[4]。目前黄酮类化合物的提取方法主要有水提取、加热回流提取、碱提酸沉、乙醇提取、微波辅助提取、超声波辅助提取和超临界萃取等[12-13]。其中，超临界CO2萃取技术具有溶剂安全性高且易回收、产品提取率相对较高、同时对原有物质的化学成分不会造成损伤等优点，是一种环保型的绿色分离技术，现已成为获得高纯度活性成分的有效手段之一[14-15]。武陵山区红麸杨资源极其丰富，但目前仅仅开发利用其五倍子，果实还未得到有效开发利用。在前期研究基础上，本研究采用 0～10 ℃低温下超微粉碎红麸杨果实后，运用超临界CO2萃取其黄颜木素，采用正交试验优化萃取工艺，并测定了黄颜木素的体外抗氧化活性，以期提高黄颜木素纯度与提取率的同时，尽量减少材料处理与提取分离纯化过程对黄颜木素生物活性的影响，从而为黄颜木素的开发利用提供物质基础，也为红麸杨果实的开发利用提供依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

红麸杨果实采于吉首大学张家界校区后山，经鉴定为红麸杨(Rhuspunjabensisvar.sinicaRehd.)的果实。清洗后置于60 ℃恒温干燥箱中烘干，备用。甲醇、无水乙醇、乙腈，均为国产分析纯。HPLC检测用乙腈、磷酸为国产色谱纯。不同体积分数的甲醇、乙醇等未加说明都是以去离子水与分析纯溶剂混合而得。黄颜木素(98.0%，20725- 03-5)，云南西力生物；VC(99.7%，20170115)，天津市光复科技发展有限公司；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)，美国Sigma公司；总抗氧化能力(T-AOC)测试盒、超氧阴离子测定试剂盒、羟基自由基测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

XDW- 6J型振动式细胞级超微粉碎机，济南达微机械有限公司；BHS-113明场显微镜，日本Olypus公司；HA121-50- 05超临界CO2萃取仪，江苏南通仪创实验仪器有限公司； UV-3900紫外-可见分光光度计，日本日立公司；PLC-20AT高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；SF-6脂肪抽出装置，日本三绅公司。

1.2 原料的预处理

1.2.1红麸杨果实干粉的制备 每次在超微粉碎机6 L物料器中装入已干燥的红麸杨果实1.2 L，将温控设置为0～10 ℃，设置间歇性粉碎3次，每次粉碎5 min，间隔3 min，将明场显微镜转换成偏光镜后对果粉进行镜检，果粉密封干燥，保存备用。

1.2.2红麸杨果粉脱脂 每次称取1.2.1节果粉60 g，置于脂肪抽出装置中，加入石油醚(60～90 ℃)250 mL，回流脱脂。抽滤、滤渣挥干溶剂后，保存备用。

1.3 超临界CO2萃取黄颜木素

1.3.1夹带剂的选择 选用工业酒精、70%乙醇、无水乙醇、70%甲醇和甲醇5种试剂作为夹带剂，在萃取压力30 MPa，萃取温度55 ℃，分离釜Ⅰ压力10 MPa、分离釜Ⅰ温度50 ℃，分离釜Ⅱ压力5 MPa、分离釜Ⅱ温度40 ℃，CO2流量20 L/h条件下萃取2 h，同时以未加夹带剂为对照，从中筛选出一种较适合的夹带剂。

1.3.2正交试验优化 利用1.3.1节所选择的夹带剂，按文献[16]中L9(34)正交试验探索果粉与夹带剂固液比、萃取压力、萃取温度和萃取时间等4个因素对黄颜木素得率的影响，从而得到超临界CO2萃取红麸杨果粉中黄颜木素的最佳工艺参数。

1.3.3验证实验 根据1.3.2节优化得到的工艺参数进行萃取：即取红麸杨果粉500.0 g置于2 L的料筒中，装入萃取釜，装好压环及密封圈，旋紧其堵头，然后严格按规定程序操作并回流萃取。萃取时间达到所设定时间时，关闭相应阀门、高压泵等，回收CO2，从分离釜出料口出料，收集萃取物并干燥，以干燥物质量除以500.0 g为黄颜木素萃取物的得率，并测定萃取物纯度。

1.4 黄颜木素纯度的测定

1.4.1对照品溶液的配制 精密称取黄颜木素标准对照品2.0 mg，加乙腈溶解后定容至100 mL容量瓶中，得20 mg/L的对照品储备液，保存，备用。

1.4.2HPLC标准曲线的绘制 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈- 0.4%磷酸(体积比19 ∶81)；紫外检测器检测；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。精密量取1.4.1节配制的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL分置25 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成0、1.6、3.2、4.8、6.4和8.0 mg/L的标准对照品溶液，摇匀、用0.45 μm滤膜过滤后，依次进样10 μL检测(进样3次)，以峰面积积分值的平均值为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合出回归方程。

1.4.3纯度的测定 按1.4.1节方法配制萃取物样品溶液，再按1.4.2节高效液相色谱分析条件，用 0.45 μm 滤膜过滤后依次进样10 μL检测(进样3次)，进行高效液相色谱检测，按峰面积归一法计算黄颜木素的纯度。

1.5 黄颜木素体外抗氧化性能测定

1.5.1DPPH·清除率测定 取优化条件下得到的萃取物样品，按照1.4.1节方法配制成质量浓度分别为2.5、5、10、20、30和40 mg/L的黄颜木素样品溶液。精密移取2.0 mL样品溶液于试管中，称取一定量的DPPH·用无水乙醇溶解并配制成0.20 mmol/L溶液，取2.0 mL加入样品溶液试管，混匀。在室温下避光反应30 min后，测其A517 nm值[17]，平行测定3次。以VC为阳性对照，精密称取一定量的VC配制成相应质量浓度，按上述方法操作。DPPH·清除率(ηDPPH·)测定结果按式(1)计算：

ηDPPH·=(A0-A1)/A0×100%

(1)

式中：A0—无水乙醇对照液517 nm处的吸光度值；A1—测定样液517 nm处的吸光度值。

1.5.2·OH清除率测定 本实验使用建成生物工程研究所的·OH试剂盒测定红麸杨果实中质量浓度分别为10、20、40、80、120和160 mg/L的黄颜木素对·OH的清除效果。严格按试剂盒说明书操作，超纯水调零，测其A550 nm值，平行测定3次。·OH清除率(η·OH)测定结果按式(2)计算：

η·OH=(A′0-A2)/A′0×100%

(2)

式中：A′0—无水乙醇对照液550 nm处的吸光度值；A2—测定样液550 nm处的吸光度值。

(3)

式中：A″0—无水乙醇对照液在550 nm处的吸光度值；A3—测定样液在550 nm处的吸光度值。

1.5.4总抗氧化能力测定 本实验使用建成生物工程研究所的总抗氧化能力(T-AOC)测试盒测定红麸杨果实中质量浓度分别为120、160、200、240、340和440 mg/L的黄颜木素体外总抗氧化能力，严格按试剂盒说明书操作，超纯水调零，测其A520 nm值，平行测定3次[18]。总抗氧化能力(η总)测定结果按式(4)计算:

η总=(A4-A‴0)×N×n/(0.01×30)

(4)

式中:A‴0—无水乙醇对照液在520 nm处的吸光度值；A4—测定样液在520 nm处的吸光度值；N—反应体系稀释倍数(反应液总量/取样量)；n—样品测试前稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 超微粉碎果实干粉的结果分析

红麸杨果实在温度设置为0～10 ℃、间歇性粉碎3次，每次粉碎5 min，间隔3 min，粉粒运用偏光显微镜进行镜检，结果显示粉体粒径在0.1～1 μm范围内，细胞破壁率达到95%以上。

2.2 黄颜木素的HPLC检测

2.2.1HPLC标准曲线的绘制 黄颜木素标准对照品溶液HPLC图谱见图1(a)，以对照品梯度浓度溶液所得峰面积积分值的平均值为纵坐标(Y)，溶液质量浓度为横坐标(X)绘制回归曲线，所得拟合曲线回归方程：Y=139 869X+10 315，R=0.999 6，表明黄颜木素标准对照品溶液在0～8.0 mg/L范围内线性关系良好。

2.2.2萃取物的HPLC检测 优化条件下萃取所得黄颜木素样品的HPLC检测图谱见图1(b)，与黄颜木素标准对照品(图1(a))相对比，两者均在12.5 min左右具有较大特征峰。按2.2.1节回归方程以峰面积归一法计算超临界CO2萃取所得黄颜木素的纯度为80.26%，其纯度要明显高于文献[4]中酶辅助提取红麸杨果实中黄颜木素的纯度(14.59%)以及经大孔吸附树脂XDA-8精制后的纯度(68.15%)，说明加入70%乙醇溶液作为夹带剂后，超临界CO2萃取技术的提取和蒸馏双重作用对红麸杨果粉中单味成分黄颜木素是非常有效的。

图1 黄颜木素标准对照品(a)和萃取物样品(b)溶液的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of dihydrofisetin standard(a) and extract(b)

2.3 超临界CO2萃取工艺的优化

2.3.1夹带剂的选择 超临界CO2萃取红麸杨果粉中黄颜木素时，由于纯CO2对黄酮类化合物的溶解度不高，如果不加夹带剂萃取物中大部分是易挥发油或精油，黄酮类化合物的含量会很低。夹带剂的加入可以改善系统的极性，有利于提高产物得率[19]，这也是本研究超临界CO2萃取红麸杨果粉之前要用石油醚脱脂的原因。由于乙醇在超临界CO2流体中的溶解度很大且无毒，往往作为首选夹带剂。本研究考察发现工业酒精、70%乙醇、无水乙醇、70%甲醇和甲醇这5种夹带剂存在时的萃取物得率分别为0.386%、0.408%、0.424%、0.403%和0.417%，本实验最终选择70%乙醇溶液为夹带剂。

2.3.2正交试验优化 按照文献[16]方法进行L9(34)正交试验，正交试验设计及结果见表1，方差分析见表2。由正交试验及方差分析可知，各因素对红麸杨果实中黄颜木素得率的影响大小依次为果粉与夹带剂固液比>萃取时间>萃取压力>萃取温度，通过直观分析和极差分析得到萃取的最佳条件为：果粉与夹带剂固液比5 ∶3(g ∶mL)、萃取压力30 MPa、萃取温度55 ℃、萃取时间2 h、分离釜Ⅰ的温度55 ℃、压力10 MPa、分离釜Ⅱ的温度35 ℃、压力5 MPa。

2.3.3验证实验 在上述优化工艺条件下，采用超临界CO2萃取500.0 g红麸杨果粉，所得黄颜木素萃取物的得率仅为0.46%，其得率要明显低于前期酶辅助提取红麸杨果实中黄颜木素的得率1.35%[4]，但前者纯度为80.26%，后者纯度仅为14.59%。也就是说，超临界CO2萃取红麸杨果粉中黄颜木素的得率达到了3.69 mg/g，相反酶辅助提取红麸杨果粉时得率可达1.35%，纯度仅为14.59%，其黄颜木素的得率仅为1.97 mg/g。这是由于超临界CO2萃取技术将萃取、分离(精制)和除去溶剂等多个单元过程合为一体，简化了工艺流程，从而提高了黄颜木素的纯度。

表1 正交试验设计及结果

表2 正交试验方差分析

2.4 体外抗氧化性能分析

2.4.1DPPH·清除率 如图2(a)所示，黄颜木素表现出较强的DPPH·清除能力，随着黄颜木素质量浓度的增加，供试品溶液对DPPH·的清除率逐渐升高。当黄颜木素质量浓度为40 mg/L时，DPPH·的清除率为89.76%，且在试验设定的质量浓度范围内呈一定的线性量效关系。此外，黄颜木素对DPPH·的清除能力接近于VC。通过线性拟合清除率曲线，计算得到黄颜木素对DPPH·的IC50值为6.93 mg/L。黄颜木素作为三酚羟基的双氢黄酮保证了它提供质子的能力，从而达到清除DPPH·的效果，其具体机制还有待进一步研究。

2.4.2·OH清除率 如图2(b)所示，黄颜木素表现出很强的·OH清除能力，随着质量浓度的增加，黄颜木素和VC对·OH的清除率均逐渐增加。当黄颜木素质量浓度为80 mg/L时，·OH的清除率为92.38%，且在试验设定的质量浓度范围内呈一定的线性量效关系。而VC质量浓度为160 mg/L时，·OH 的清除率仅为39.85%。由此可见，黄颜木素对·OH具有很强的清除能力，而且其清除能力明显高于VC。通过线性拟合清除率曲线，计算得到黄颜木素对·OH的IC50值为9.05 mg/L。清除机理是否为黄颜木素酸性较强的酚羟基的氢与羟基自由基结合，从而达到清除效果还有待进一步研究。

2.4.4总抗氧化能力 如图2(d)所示，黄颜木素表现出较强的总抗氧化能力，且在试验设定的质量浓度范围内呈一定线性量效关系，总的来说其总抗氧化能力强于VC。

a.DPPH·; b.·OH; d.总抗氧化能力total antioxidant capacity图2 黄颜木素的体外抗氧化性能Fig.2 The antioxidant properties of dihydrofisetin in vitro

3 结 论

3.1红麸杨果实经超微粉碎、脱脂处理后，采用超临界CO2萃取黄颜木素，通过正交试验优化萃取工艺。结果表明：最佳的萃取工艺条件为以70%乙醇为夹带剂、果粉与夹带剂固液比5 ∶3(g ∶mL)、萃取压力30 MPa、萃取温度55 ℃、萃取时间2 h、分离釜Ⅰ的温度55 ℃、压力10 MPa、分离釜Ⅱ的温度35 ℃、压力5 MPa。在此条件下，黄颜木素萃取物的得率为0.46%，纯度为80.26%，虽然萃取物得率较低，但其纯度达到了80.26%，远高于前期研究中酶辅助提取的纯度(14.59%)以及用XDA-8大孔吸附树脂吸附分离纯化后的纯度(68.15%)。

3.3运用超临界CO2萃取红麸杨果粉中黄颜木素，既简化了工艺流程，又能提高黄颜木素的提取得率，而且对黄颜木素的纯化程度也较高，但运行经济成本相对较高。因此，超临界CO2萃取只适合提取与分离纯度要求较高的黄颜木素。