无患子果皮提取物化学成分及其对白色念珠菌的抑制作用

邱金丹， 李 璐， 魏敏平， 谢云飞， 于 航， 姚卫蓉

(江南大学 食品学院， 江苏 无锡 214122)

无患子，一种生长于中国南部和西部的落叶乔木，其果皮中含有的皂苷类成分已被广泛应用于清洁产品[1]。目前，关于无患子果皮的化学成分及其生物活性已有一些报道，其化学成分主要为五环三萜类齐墩果烷型皂苷[2-3]。无患子果皮具有抗炎、镇痛、抗肿瘤活性等多种功效[3-4]。白色念珠菌是一种条件致病菌，可导致外阴阴道念珠菌病，影响女性生活质量[5]。目前，阴道局部用药或口服唑类抗生素是首选治疗方法，然而，过度使用抗生素会使白色念珠菌产生耐药性[6]。因此，用抗真菌的天然产物治疗念珠菌已成为研究重点。近年来，已有研究证明天然活性成分，如甲酰基间苯三酚萜类化合物、原花色素聚合单宁等对白色念珠菌具有抑制作用，可导致其生物膜受损[7-8]。目前对无患子抑制白色念珠菌的研究主要集中在体外抑菌方面，如无患子甲醇提取物和醇提-大孔树脂洗脱物对白色念珠菌的最低抑菌浓度分别为0.625和0.312 5 g/L[9-10]，90%无患子乙醇提取物可破坏白色念珠菌的细胞壁和细胞膜[5]。然而对无患子体内抑制白色念珠菌活性的研究较少，如用90%无患子乙醇提取物体内治疗小鼠念珠菌，仅以真菌载量表示治疗结果[11]，缺少对无患子体内抑制白色念珠菌活性的全面考察。本实验室已经做了大量有关无患子的研究工作，包括无患子果皮总皂苷的分离提取及纯化[1]，体外抑制真菌和细菌活性筛选[2-3]以及抗乳腺肿瘤研究[4]，积累了大量详实数据。因此，基于前期研究结果，本研究采用水提发酵法和醇提法分别提取无患子果皮皂苷，得到水提发酵物(WFE)和醇提物(EE)，对其化学组成差异进行分析；并通过最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)指标考察提取物的体外抑制白色念珠菌活性；同时建立外阴阴道炎念珠菌(VVC)模型，考察2种提取物的体内治疗效果，以期为无患子活性成分的分离鉴定及在医药领域的应用提供理论依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

无患子果皮，由福建源华林业生物科技有限公司提供，该样品的标本存放于中国科学院昆明植物研究所植物标本室。无水乙醇、乙酸、高氯酸(70%～72%)、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、香草醛均为分析纯，沙氏培养基，购自国药集团化学试剂有限公司；齐墩果酸标准品(纯度98%)和氟康唑(纯度98.5%)，购自上海百灵威试剂公司；白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231，购自北京百欧博伟生物有限公司；安琪葡萄酒干酵母BV818，来自江南大学食品学院食品安全与质量控制研究中心。

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；GI54DWS型立式压力蒸汽灭菌器，厦门致微仪器有限公司；HWS恒温恒湿培养箱，宁波江南仪器厂；沃特世MALDI SYNAPT MS型超高效液相色谱-质谱联用仪，沃特世科技(上海)有限公司；恒温水浴锅，上海试验仪器厂。

1.2 无患子果皮中皂苷的提取

1.2.1水提发酵法 参考文献[12]，将一定质量无患子果皮粉碎至0.42～0.84 mm，在40 ℃的恒温水浴锅中，将果皮粉末与蒸馏水按照质量比1 ∶7提取8 h，用纱布过滤，滤渣再按质量比1 ∶3提取2 h，用纱布过滤，得到第二次滤渣再按质量比1 ∶1.5提取1 h，用纱布过滤得到第三次滤液，弃去滤渣，合并3次滤液。将粗滤液以5 000 r/min离心10 min得到无患子水提液，于蒸发设备中浓缩至体积为原水提液体积的1/6，得到无患子皂苷浓缩液。选择安琪葡萄酒干酵母BV818为发酵菌株，以1.5%接种量，在30 ℃下发酵4 d得到无患子水提发酵物(WFE)。

1.2.2醇提法 将一定质量无患子果皮粉碎至0.42～0.84 mm，在75 ℃的恒温水浴锅中，将果皮粉末与70%的乙醇溶液按质量比1 ∶5混合提取3 h，用纱布过滤，将得到的滤渣在相同温度、溶剂和质量比下再重复提取2次，合并3次滤液。将粗滤液以5 000 r/min离心10 min后，于蒸发设备中浓缩至体积为原醇提液体积的1/6，得到无患子醇提物(EE)。

1.3 无患子果皮提取物中总皂苷的测定

通过香草醛-浓硫酸分光光度法[1]测定无患子提取物中总皂苷含量。标准曲线的制作：配置1 g/L齐墩果酸标准溶液。取干燥洁净的试管，分别加入0、30、60、90、120和150 μL齐墩果酸标准溶液，置于50 ℃水浴烘干水分，先后加入0.4 mL质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液和1.4 mL高氯酸为显色剂，振荡混匀。置于70 ℃水浴中加热20 min，冰水浴冷却至室温，再加入10 mL冰醋酸作为溶剂，充分混匀。用紫外分光光度计在540 nm处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，皂苷质量浓度(c)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为：A=0.003 5c-0.028 3,R2=0.998 9。样品测定：将WFE和EE稀释适当倍数，取100 μL稀释液于试管中，重复上述操作测定。

固形物含量参照文献方法测定[13]，无患子总皂苷得率(y)和纯度(η)计算方法见式(1)～式(3)：

m1=c×n×V

(1)

y=m1/m0×100%

(2)

η=m1/m2×100%

(3)

式中：m1—无患子总皂苷质量，g；c—总皂苷质量浓度，g/L；n—稀释倍数；V—提取液总体积，L；m0—无患子果皮质量，g；m2—固形物总质量，g。

1.4 无患子果皮提取物的化学成分分析

HPLC-DAD/MS检测条件：BEC C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相A：乙腈，流动相B：水。在初始阶段，梯度为40%A和60%B，20 min时为60%A和40%B，持续30 min。流速为1 mL/min，柱温为45 ℃，进样量5 μL。在负离子模式下使用电喷雾电离(ESI)源，N2雾化的压力为275.8 kPa，在350 ℃ 的温度下干燥N2的流速为9 L/min，毛细管电压为3.0 kV，质量范围(m/z)为100～3 000，离子源温度为120 ℃。

1.5 无患子果皮提取物的抑菌活性研究

1.5.1最小抑菌浓度(MIC)的测定 参照文献[2]方法，分别配制无患子总皂苷终质量浓度为125、 62.5、 31.25和15.63 mg/L的固体培养基，在凝固后的试管培养基中加入20 μL活化后的106CFU/mL白色念珠菌ATCC10231菌悬液。以氟康唑作为阳性对照，以生理盐水作为阴性对照，样品及对照分别做3个平行。将加入菌株的培养基置放在恒温恒湿培养箱内，37 ℃培养16～24 h后观察结果，其中无菌落生长对应的浓度作为最小抑菌浓度(MIC)。

1.5.2最低杀菌浓度(MBC)的测定 参照文献[13]方法，将无患子WFE和EE中总皂苷质量浓度稀释接近MIC，分别在900 μL总皂苷质量浓度为555、 277、 139和69 mg/L的WFE和EE中加入106CFU/mL的菌悬液100 μL，得到总皂苷质量浓度为500、 250、 125和62.5 mg/L的混合液，37 ℃水浴保持60 min；吸取各含菌提取物100 μL涂布于沙氏培养基中，37 ℃培养16～24 h后观察生长情况，其中无菌落生长对应的浓度作为最低杀菌浓度(MBC)。

1.5.3对白色念珠菌型阴道炎小鼠的治疗作用 取40只八周龄小鼠(品系ICR)，随机挑出8只作为空白对照组，其余隔天皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/只)刺激假发情，连续注射一周。最后一次刺激后，小鼠感染由PBS缓冲液配置的白色念珠菌菌悬液(108CFU/mL)，每只20 μL，连续感染两天。随机将小鼠分为4组，即阴性对照组、阳性对照组(氟康唑组)、WFE和EE组。通过阴道灌注的方式，空白对照组和阴性对照组灌注50 μL PBS缓冲液，阳性对照组灌注2 g/L氟康唑溶液，WFE和EE组分别灌注10 g/L的相应药物，每天一次，持续11天，并在第0、5、10、11天用50 μL PBS缓冲液灌洗阴道3次，涂布于沙氏琼脂平板确定真菌载量。取治疗第11 d阴道灌洗液，酶联免疫吸附(ELISA)测定细胞因子(IL-1β，IL-6，IL-8)和乳酸脱氢酶(LDH)。断颈法处死小鼠，取阴道组织，石蜡包埋，HE染色，镜下观察病理变化。

2 结果与讨论

2.1 无患子果皮中皂苷的提取结果分析

采用水提发酵法和醇提法分别提取无患子果皮中的皂苷，得到WFE和EE中总皂苷得率分别为(13.05±0.82)%和(13.82±0.58)%，纯度分别为(80.23±0.95)%和(75.50±0.31)%。2种方法均表现出良好的重现性，且得率相近，WFE纯度更高，为80.23%。近年来，也有研究者用不同的方法提取无患子皂苷，如无水乙醇提取无患子果皮得到的皂苷得率为9.32%[14]；用9种不同的溶剂分别提取无患子皂苷，效果最好的提取溶剂是丙酮，纯度为72.63%[15]。本研究中EE在得率和纯度上都具有优势，另外，在得率相近的前提下，WFE具有较高的纯度，这是由于微生物具有丰富的分解糖类、蛋白质、脂类的酶类，但无法利用发酵液中皂苷类活性成分，从而达到去除杂质、保留富集有效成分的效果[15-16]。

2.2 无患子果皮提取物的化学成分分析

在负离子模式下对2种提取物进行HPLC-DAD/MS检测，总离子流色谱图如图1所示，共鉴定出13种无患子皂苷，如表1所示。由图1和表1可知，皂苷类物质的出峰时间主要在10～20 min之间，其中WFE和EE的三萜皂苷各占66.07%和80.39%。2种提取物中有11种共有皂苷，其中6种倍半萜皂苷和5种三萜皂苷。WFE中峰面积最大的皂苷为Sapindoside B，占总峰面积的42.35%。EE中峰面积最大的皂苷为Sapinmusaponin L，占总峰面积的46.75%，这两种皂苷均属于三萜皂苷。据报道[17]，无患子三萜皂苷具有较强的抗真菌功效，从无患子水提物中分离出的齐墩果烷型三萜皂苷对红色毛癣菌具有抑制作用。另外，无患子果皮中皂苷的抗真菌活性及其构效关系的结果表明倍半萜皂苷混合物无抑菌活性[22]。因此，三萜皂苷是无患子果皮中具有极大利用价值的一类皂苷，可以用来进一步的深入利用，也可作为抑菌活性物质分离的目标。

表1 无患子WFE和EE化学成分分析
Table 1 Component analysis of WFE and EE

类型type编号No.化合物名称 compound name 分子式formula峰面积peak area/%WFEEE参考文献reference倍半萜皂苷sesquiterpene saponins1mukuroziosideⅠbC45H76O240.630.43[2]2mukuroziosideⅡbC51H86O283.763.81[2]3mukuroziosideⅠaC45H78O245.904.29[2]4mukuroziosideⅡaC51H88O288.665.86[2]5pyishiauosideⅠbC33H56O154.531.08[2]66′/4″/6″″/4″″-O-acetylmukurozioside ⅡaC53H90O2910.454.14[16]三萜皂苷triterpenoid saponins7mukurozisaponin YC58H94O264.432.36[2]8sapindoside CC46H74O163.353.41[17]9matesaponin 1/1′C47H76O171.87—[18]10sapindoside BC46H74O1642.3525.00[19～20]11sapinmusaponin LC48H76O1712.8246.75[21～22]12oleanolicacid 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosideC46H74O151.251.77[17]13mukurozisaponin GC50H78O18—1.1[23]

2.3 无患子果皮提取物的抑菌活性分析

采用最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)来比较无患子WFE和EE(以总皂苷计)对白色念珠菌的体外抑菌活性，结果发现：WFE、EE和氟康唑的MIC值分别为62.50、 31.25和2.00 mg/L，MBC值分别为250、 125和4.00 mg/L。当MIC值低于100 mg/L时，植物提取物的体外活性被认为是显著的[23]。因此，无患子WFE和EE均具有显著的体外抑制白色念珠菌的作用，可以将无患子果皮提取物作为医药原料进行深入开发。

2.4 无患子果皮提取物的体内抑菌活性

2.4.1真菌载量 小鼠阴道灌洗液的真菌载量能直观地反映白色念珠菌的变化，结果见表2。治疗前(0 d)，与空白组比较，阴性对照组、阳性对照组、WFE组和EE组阴道内菌落均显著增加(P<0.05)；与阴性对照组相比，阳性组、WFE组和EE组均无显著性差异，表明已成功建立小鼠阴道炎模型。

各组别菌落数结果表明：从治疗开始，菌落数随着时间推移逐渐减少；治疗第10 d，与阴性对照组相比，WFE组与阳性对照组阴道内真菌载量均显著下降(P<0.05)，说明氟康唑和WFE能够抑制小鼠体内白色念珠菌活性，而EE组在治疗的11 d中，小鼠阴道内真菌载量均无显著下降，说明EE不能有效抑制白色念珠菌的生长。

表2 无患子WFE和EE对VVC小鼠阴道内真菌载量的影响1)

1) #：与空白组比较compared with blank group，P<0.05；与阴性对照组比较compared with negative control group，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；下表同the same as following table

2.4.2炎症因子 白色念珠菌从酵母到菌丝的形态转变可导致阴道上皮细胞的损伤，诱发炎症反应，产生炎症因子[24]。炎症因子指标高，表示阴道上皮细胞炎症反应严重，炎症因子指标降低，表示白色念珠菌对上皮细胞的损伤得到减轻，活性受到抑制。

测定了3个与阴道炎相关的炎症因子指标(IL-1β，IL-6和IL-8)，结果见表3。与空白组相比，阴性对照组的IL-1β，IL-6和IL-8显著升高(P<0.05)，表明白色念珠菌已感染阴道上皮细胞，诱发炎症反应，说明小鼠阴道炎造模成功。与阴性对照组相比，阳性对照组和WFE组的IL-6和IL-8显著降低(P<0.05)，EE组无显著性差异，表明阳性药物氟康唑和WFE能够减轻阴道上皮细胞炎症反应，抑制白色念珠菌的活性，具有治疗作用，而EE组不能抑制白色念珠菌活性，无治疗作用。阳性对照组与WFE组的IL-6和IL-8无显著性差异，说明10 g/L WFE的抑制作用与2 g/L氟康唑相当。

2.4.3乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶(LDH)可以判别由白色念珠菌引起的阴道组织损伤程度。如表3所示，与空白组相比，阴性对照组的LDH指标显著升高(P<0.05)，表明小鼠阴道炎造模成功。与阴性对照组相比，阳性对照组、WFE组和EE组的LDH指标显著降低(P<0.05)，表明3个治疗组均能够减轻白色念珠菌引起的组织损伤程度，具有治疗作用。WFE组与阳性对照组的LDH指标无显著性差异，却比EE组显著降低(P<0.05)，说明10 g/L WFE的治疗效果与2 g/L氟康唑相当，且优于EE。

表3 无患子WFE和EE对VVC小鼠阴道内炎症因子和乳酸脱氢酶的影响

2.4.4病理切片 小鼠阴道组织由管腔(L)，黏膜(M)和黏膜下层(SM)组成[25]。如图2所示，空白组小鼠组织排列清晰，层次分明；阴性对照组的黏膜层(M)增厚，部分上皮细胞严重坏死脱落(箭头标注处)。与阴性对照组相比，阳性对照组、WFE组和EE组的黏膜层(M)均较薄，上皮细胞仅有轻微脱落现象，表明3者都能不同程度地减轻白色念珠菌感染阴道组织的症状；且WFE组的改善效果比EE组的稍好；但与未感染前的空白对照组相比，治疗11 d后， 3者的黏膜层(M)都不能恢复到未感染前的状态。

L.管腔lumen; M.黏膜mucosa; SM.黏膜下层submucosa a.空白blank； b.阴性对照negative control； c.阳性对照positive control； d.WFE； e.EE图2 无患子WFE和EE对VVC小鼠阴道组织病理改变的影响(×200)Fig.2 Effect of WFE and EE on vaginal histopathological examinations(×200)

据报道，对64种天然产物进行体内外抑菌实验，结果仅有16种体内外抑菌一致性[26]。因此，本研究在考察无患子WFE和EE体外抑菌活性的基础上，比较了两者的体内抑菌效果。研究证明：与阴性对照组相比，WFE能够有效抑制小鼠阴道内白色念珠菌的生长，降低炎症因子(IL-6，IL-8)的合成和释放，WFE和EE均能减轻阴道组织损伤程度，但EE的治疗效果较差。该研究结果证明无患子果皮提取物体内外抑制白色念珠菌活性一致性，可以为开发无患子果皮应用于医药领域提供理论依据。

3 结 论

3.1采用水提发酵法和醇提法提取无患子果皮，得到WFE和EE这2种提取物，通过HPLC-DAD/MS对提取物的化学成分进行分析。结果表明：WFE中总皂苷纯度(80.23%)高于EE纯度(75.50%)，提取物中共有13种无患子皂苷，包括7种三萜皂苷和6种倍半萜皂苷，其中三萜皂苷为主要成分，在WFE和EE中分别为66.07%和80.39%。

3.2采用最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)作为抑菌指标，比较了2种无患子提取物的体外抑菌作用，结果表明：WFE(MIC值为62.5 mg/L, MBC值为250 mg/L)和EE(MIC值为31.25 mg/L,MBC值为125 mg/L)均具有显著的体外抑菌活性。

3.3建立外阴阴道炎念珠菌(VVC)小鼠模型，考察2种提取物的体内治疗效果，结果显示：与阴性对照组相比，WFE能显著降低(P<0.05)VVC小鼠阴道内的真菌载量和炎症因子(IL-6，IL-8)，减轻阴道组织损伤程度；而EE仅能减轻组织损伤程度，且效果较WFE差。因此，无患子果皮提取物具有体内外抑制白色念珠菌活性的作用，从治疗角度，WFE效果更好。