靶向蛋白质降解技术研究进展

郝亚锋，王汉杰

(天津大学生命科学学院，天津 300072)

干扰特定蛋白表达是研究蛋白质功能的重要途径，也是用于治疗由蛋白异常表达引起的相关疾病的重要措施。近年来,干扰特定蛋白表达技术的发展引起了生命科学技术领域的变革，从最早出现的通过封闭靶蛋白的活性位点发挥作用的化学抑制剂到基于DNA与RNA水平发挥作用的RNAi技术[1]与CRISPR-Cas9技术[2]等，都在一定程度上发挥了敲低目标蛋白的功能。然而随着研究的深入也暴露了技术的局限性：化学抑制剂只有在高浓度化合物的作用下与目标蛋白的活性位点结合才能发挥效应[3]，具有很高的细胞毒性[4]；RNAi技术与CRISPR-Cas9技术虽然在一定程度上解决了化学抑制剂的缺陷，但是容易产生脱靶效应[5]，作为一种间接方式，干扰特定蛋白表达所需的时间较长，导致细胞有足够长的时间激活补偿机制，恢复原有的蛋白质水平[6-7]，同时也无法确定目的蛋白表达量的下降是否与基因水平早期缺陷有关。

靶向蛋白质降解技术(targeted protein degradation technology)是近年来发展起来的干扰蛋白质功能、维持胞内蛋白质稳态的新技术。与上述技术相比，靶向蛋白质降解技术是调控蛋白表达最直接和有效的方式之一，其可特异性地识别靶蛋白，利用细胞内固有的蛋白质降解途径直接在蛋白质水平降解靶蛋白，提高了敲除靶蛋白的效率以及省略了长时间调控过程中产生的中间效应，为研究特定蛋白质的功能和治疗由蛋白异常表达引起的疾病提供了新方法，因此逐渐受到研究者的关注。靶向蛋白质降解技术从诞生起，便不断获得优化，在生物医学研究中得到广泛应用。然而随着研究的深入，现有的靶向蛋白质降解技术也面临着新的机遇和挑战，探索更加安全、高效、精准、可控的新型靶向蛋白质降解技术成为当前研究的主要方向。

1 细胞内固有的蛋白质降解途径

细胞中的蛋白质稳态主要依赖细胞内固有的蛋白质降解途径的协调运作维持，即分子伴侣蛋白系统与两个蛋白质水解系统，其中自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway)和泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)在蛋白质降解中发挥着重要的生物学功能。

1.1 自噬-溶酶体途径

自噬-溶酶体途径是非特异性蛋白质降解途径，主要与表面膜蛋白和胞吞的胞外蛋白质、完整细胞器和蛋白多聚体的降解相关，在调控细胞内蛋白质降解中不发挥主要作用。溶酶体是真核细胞内重要的细胞器，属于内膜系统的重要组成组分，内含多种酸性水解酶，能够分解蛋白质、核酸、多糖及脂类等。其主要作用机理为：当细胞受到饥饿、压力、高温、低氧、细胞器损坏、蛋白质突变或者微生物感染等条件的刺激，会引发细胞自噬，蛋白质等大分子在溶酶体的酸性环境中被相应的酶降解，然后通过溶酶体膜的载体蛋白运送至胞液的代谢库[8]。

1.2 泛素-蛋白酶体途径

泛素-蛋白酶体途径是细胞内最重要的蛋白质降解途径，具有高度特异性和选择性[9]，是细胞内环境稳定的关键调节因素，负责降解细胞80%的正常或异常的蛋白[10]，并在细胞周期调控、信号转导、核酸密码翻译等多种生命过程中发挥重要作用[11]，是目前细胞内参与靶向蛋白质降解技术的主要途径。

泛素-蛋白酶体途径主要包括：泛素(ubiquitin,Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)、泛素连接酶(ubiquitin ligase,E3)、26S蛋白酶体(26S proteasomes)、去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)等。

泛素-蛋白酶体途径的主要作用机理(图1)：E1利用ATP水解释放的能量，通过其活性中心的半胱氨酸残基与泛素的C端形成硫酯键活化单个游离的泛素，并将泛素呈递给E2，E3具有特异性识别靶蛋白的能力，其通过招募底物蛋白和E2，介导泛素从E2转移到靶蛋白并与靶蛋白共价结合，蛋白酶体催化泛素与靶蛋白的偶连体降解。泛素-蛋白酶体途径的作用过程属于可逆过程，其通过E1、E2、E3与DUBs共同维持平衡。单泛素化不能介导靶蛋白降解，只起到一定程度的调节作用，只有当4个及4个以上被激活的泛素分子连接到靶蛋白上形成多聚泛素链时，底物才能被输送至蛋白酶体进行降解，而多聚泛素链在泛素再循环酶的作用下分解成单个泛素分子，重新循环利用。

图1 泛素-蛋白酶体途径的主要作用机理Fig.1 Main reaction mechanism of ubiquitin-proteasome pathway

2 靶向蛋白质降解技术的发展与应用

靶向蛋白质降解技术从诞生起就受到了研究者的广泛关注，其发展历经了从无选择性的热休克蛋白抑制剂、到意外发现的选择性雌激素受体降解剂(selective estrogen receptor modulator,SERM)、到机理未知的疏水性标签(hydrophobic tagging,HyT)、再到被广泛应用于多种生物医学研究的蛋白降解靶向嵌合体(proteolytic targeting chimera,PROTAC)技术，在研究过程中不断完善和发展。

2.1 选择性雌激素受体降解剂

氟维司群(Fluvestrant)，是一种意外发现的SERM，属于完全拮抗剂[12]，目前已被批准用于治疗晚期乳腺癌。氟维司群诱导受体蛋白降解的机制还未完全清楚，通常认为是该化合物中的雌二醇的7R-疏水链结合于受体的疏水域，导致构象改变，招募蛋白酶体，降解了高表达的雌激素受体。与SERM相对应的还有选择性雄激素受体降解剂(SARD)，利用SARD降解雄激素受体是治疗前列腺癌的重要途径。

2.2 疏水性标签

HyT技术是将疏水性部分经连接链(linker)与目标蛋白上可结合的配体连接，从而附加到靶蛋白的表面，使靶蛋白模拟未折叠的蛋白质状态，并利用胞质未折叠蛋白响应系统来降解靶蛋白。

HyT技术的作用机理(图2)：HyT的配体片段识别和结合靶蛋白，并引导所连接的疏水性片段附加于靶蛋白表面，使目标蛋白构象改变，在分子伴侣的参与下被蛋白酶体降解[13]。通过共价抑制剂etacrynic acid与Boc3-Arg连接靶向降解谷胱甘肽-S-转移酶α1(GST-α1)、通过非共价抑制剂甲氨苄氨嘧啶(trimethoprim)偶联Boc3-Arg降解二氢叶酸还原酶等都是利用HyT技术实现的。

图2 HyT技术的作用机理Fig.2 Reaction mechanism of HyT technology

2.3 蛋白降解靶向嵌合体

PROTAC技术是目前在靶向蛋白质降解技术领域获得广泛研究的一项技术，属于药物研发领域。与传统小分子药物抑制剂不同，该技术通过小分子化合物将靶蛋白送入蛋白酶体并使其降解发挥作用。

2.3.1 PROTAC的理化性质和设计注意事项

PROTAC的核心是一种双功能杂合化合物[14-15]，其基本结构包括：靶蛋白配体(target-binding moiety,TBM)、E3连接酶配体(ligase-binding moiety,LBM)和将前两部分连接在一起的连接链，在实际设计过程中三部分不一定存在明显的界限，通常互相联系，共同影响PROTAC的理化性质和作用效果。(1)靶蛋白配体：PROTAC的设计一般从靶蛋白配体的选择开始，靶蛋白配体的结构大多源于已有的小分子抑制剂药物或者已有药物的改构物，在设计过程中强调其特异性选择能力以及与靶蛋白的结合能力。(2)E3连接酶配体：E3连接酶配体的选择通常要经过反复的实验推理与验证，依据与靶蛋白匹配的E3连接酶来决定，真核生物中约有600多种E3，不同的E3氨基酸序列差异很大，可识别不同的底物，具有特异性[16]，但目前为止只有少数几个被用于PROTAC的开发[17]，现已知的PROTAC常用的E3连接酶(表1)有CRBN、cIAP1和VHL等。(3)连接链：当靶蛋白配体和E3连接酶配体确定后，优化操作就集中在连接链的组成、长度[18]和连接位点上[19]。

表1 PROTAC常用的E3连接酶

Tab.1 E3 ligase commonly used in PROTAC

2.3.2 PROTAC技术的作用机理(图3)

图3 PROTAC技术的作用机理Fig.3 Reaction mechanism of PROTAC technology

当设计好的PROTAC进入细胞后，其一端的靶蛋白配体特异性识别靶蛋白并与之结合，另一端的E3连接酶配体与E3结合，从而形成POI-PROTAC-E3 ligase三元复合物，E3介导E2将靶蛋白泛素化，使被泛素分子标记的靶蛋白被蛋白酶体降解。完成降解后，PROTAC被释放，参与下一次的蛋白质降解[20]。

2.3.3 PROTAC技术在生物医学中的应用

PROTAC技术目前已经在生物医学研究领域取得了一系列进展：

(1)用于肿瘤治疗：大多数肿瘤的形成与胞内关键蛋白的异常表达有关，通过PROTAC技术敲除与肿瘤形成相关的蛋白已被广泛应用于多种癌症疾病的治疗研究中。如Wee1是一种调节细胞周期的蛋白激酶，特异性调控G2/M细胞周期检查点，Gray课题组[21]针对Wee1开发了一种选择性的Weel降解剂ZNL-02-096，可在比Wee1的小分子抑制剂AZD1775浓度低10倍的剂量下诱导细胞凋亡和G2/M期的累计，肝外细胞色素P4501B1(CYP1B1)在肿瘤细胞中高度表达，可加速不同结构的抗癌药物的失活。Zhou等[22]基于CYP1B1的抑制剂ANF，开发出了能够特异性降解CYP1B1的降解剂6A-D，能够消除DU145/CY细胞的耐药性，为恶性肿瘤耐药的疾病治疗提供了新的方法和策略。

(2)用于神经性疾病治疗：Tau蛋白是大脑表达的微管相关蛋白家族的一员，Tau蛋白在脑内的异常堆积与阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease,AD)、颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)和慢性创伤性脑病(chronic traumatic encephalopathy,CTE)都有关联[23]。Lu等[24]利用PROTAC招募Keap1-Cul3泛素连接酶成功实现了细胞内Tau蛋白的降解，为相关神经疾病研究提供了新的治疗思路。BET蛋白的降解可以减少缺血性脑卒中成年小鼠的脑水肿体积、降低促炎基因CXCL、TNFα、MMP-9等的转录，还能促进血脑屏障(BBB)的修复，Candelario-Jalil课题组[25]证明通过小分子降解剂dBET1可靶向降解BET蛋白，显示了其治疗缺血性脑卒中疾病的潜力。

(3)用于白血病治疗：人9号和22号染色体交叉易位导致BCR-ABL1融合蛋白表达，引起ABL1激酶的持续激活，从而引发慢性粒细胞白血病(CML)。Crews课题组[26]利用PROTAC技术构造了GMB-651分子用于降解BCR-ABL1融合蛋白，提供了一种新的治疗慢性粒细胞白血病的方法。

(4)用于基础代谢调节：PROTAC技术在调控基础代谢方面也显示出了相应的潜力。如Waldmann课题组[27]曾应用PROTAC技术靶向降解PDEδ从而影响脂质代谢。

3 靶向蛋白质降解技术面临的机遇与挑战

随着对靶向蛋白质降解技术研究的深入，现有技术存在的问题也逐渐显现出来：(1)由于小分子降解剂的研发与试验需要耗费一定的人力物力，现在能用靶向蛋白质降解技术敲除的靶蛋白仍然是非常小的一部分，无法满足干扰特定蛋白表达领域的需求；(2)由于蛋白质的相互作用较复杂，涉及到蛋白空间构象的正确折叠，因此靶向蛋白质降解技术本身存在着许多客观上难以逾越的障碍，包括降解剂能否与目标蛋白有效结合、是否存在脱靶效应、在细胞内发挥作用是否稳定等问题；(3)现有的靶向蛋白质降解技术多基于细胞内的泛素-蛋白酶体途径，而泛素-蛋白酶体途径主要作用于胞内蛋白，因此膜蛋白及分泌蛋白的降解仍然是目前的难点；(4)现有的靶向蛋白质降解技术在发挥作用时，存在未达到理想的降解程度、无法达到疾病治疗或蛋白质功能研究的目的、目标蛋白完全降解且细胞内与该蛋白相关的所有功能随之消失、蛋白量不足以维持机体正常生理活动等情况。因此，能够在机体中局部激活靶蛋白降解，避免对其它部位造成损伤，准确调控降解剂的活性，实时调控蛋白降解进程，势必会成为今后靶向蛋白质降解技术发展的方向。

针对靶向蛋白质降解技术在实际研究与应用中存在的问题，研究者也在不断探索对其进行改进，提高其应用价值。Clift等[28]利用细胞内一种特异性的泛素连接酶TRIM21结合抗体Fc结构域的性质，创造了一种新型的快速降解内源蛋白的方法，命名为TRIM-AWAY途径，可特异性识别不同的蛋白质甚至同一蛋白质的两种不同变体，对由蛋白变体引发的疾病研究具有重要意义。Trauner课题组[29]结合近年来发展迅速的光药理学概念，将PROTAC技术与光化学技术相结合，创造了一种带有光学开关的PROTAC，命名为PHOTACs(photochemically targeting chimeras)，可在一定波长(380～400 nm)的紫外光照射下，实现激活/失活状态转变，使靶蛋白的降解具有可调性。Bertozzi等[30]利用带有M6P标记的蛋白可与细胞表面的M6PR结合，通过细胞内的溶酶体途径将蛋白运送至溶酶体降解的性质，开发出了LYTACs技术，通过嵌合M6PR激动剂可利用细胞内溶酶体途径靶向降解分泌蛋白及膜蛋白。

综上所述，尽管靶向蛋白质降解技术在现阶段仍然存在诸多问题，但随着研究方法和技术的不断改进，靶向蛋白质降解技术必将会成为与基因编辑技术比肩的有力工具，在生物医学研究与临床应用领域发挥出巨大的优势。