链置换反应触发G-四链体DNA酶双向自组装用于高灵敏均相比色生物传感

蔡小蕾，郭 鹏，赖国松

(湖北师范大学化学化工学院，湖北 黄石 435002)

凝血酶(Tb)在人体凝血级联反应及许多生理调节过程中都起着十分重要的作用，其浓度异常变化通常可有效反映疾病的发生或发展状况[1]。因此，发展各种可方便准确检测血清等复杂基质中Tb的分析方法对于临床疾病诊断具有十分重要的意义。与其它方法相比，基于免疫等高特异性生物识别反应发展起来的生物传感器具有成本低、样品消耗量少、灵敏度高、无需大型仪器等独特优点，因而近年来被人们广泛研究和关注[2]。尽管目前国内外研究人员已围绕Tb生物传感开展了不少成功工作，但是这些传感方法大多是基于传统的异相分析模式而构建的[3-5]，因而通常涉及到固相基底繁琐的界面修饰及多步反应、洗涤和分离步骤，不仅操作复杂、分析时间长，而且还有可能在一定程度上影响方法的重复性。

与抗体相比，基于SELEX技术筛选出来的核酸适配体由于具有成本更低、稳定性更好、靶向识别范围更广等优异性能[6]，近年来被人们广泛用作一类“人工抗体”来发展各种性能优良的生物传感方法。更重要的是，作为一段具有特定碱基序列的寡核苷酸片段，核酸适配体还非常有利于与其高特异性靶向物识别反应引起的相关核酸结构变化相结合来发展各种均相生物传感方法[7]，从而有效避免传统异相分析操作繁琐、智能化程度不高等缺陷。同时，上述核酸结构变化还为在此基础上结合催化发夹组装、链置换反应、杂交链反应等各种核酸信号放大技术，来有效提高生物传感方法的分析灵敏度提供了可能[8-9]。

为此，作者在核酸设计的基础上，有机结合靶向物的高特异性核酸适配体识别作用及链置换反应来进一步触发杂交链反应，成功实现均相溶液中具有优良类过氧化酶性质的G-四链体DNA酶[10]活性结构的双向自组装，进而利用该DNA酶的灵敏催化显色反应发展一种可方便用于Tb均相检测的比色生物传感新方法。

1 实验

1.1 试剂与仪器

Tb、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，Sigma-Aldrich公司；血红素(hemin)，阿拉丁化学试剂公司；人IgG(HIgG)，武汉博士德生物技术公司。

H1、H2、H3、H4等DNA均由生工生物工程(上海)有限公司根据作者设计及定制要求合成，其碱基序列如下：

H1:5′-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGT GACTACTTTATCTACCACGGACTTTATCTGTG GGTGGT-3′

H2:5′-CCGTGGTAGATAAAGTAGTCACCCC AACCTGCCCTACCACGGACTACTTTATCTGTG GGTGGT-3′

H3:5′-AGGGCGGGTGGGTGGTGGTTGGGTATTT CACCACCCACAGATAAAGTTGGGT-3′

H4:5′-TGGGTGAAATACCCAACCACCACTT TATCTGTGGGTGGTTGGGTAGGGCGGG-3′

工作溶液为25 mmol·L-1pH值7.4的HEPES缓冲溶液；DNA稀释液为含200 mmol·L-1NaCl、2 mmol·L-1MgCl2、20 mmol·L-1KCl的20 mmol·L-1pH值7.4的Tris-HCl缓冲溶液；hemin稀释液为含0.2 mmol·L-1KCl和2 mmol·L-1NaCl的DMSO溶液。

UV-1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JN100-4型恒温混匀仪，苏州吉米诺仪器公司；DYY-600C型电泳仪，东方瑞利科技有限公司。

1.2 均相反应及检测方法

首先，将浓度为10 μmol·L-1的DNA H1、H2、H3、H4分别于95 ℃水浴加热10 min，之后缓慢降温以形成稳定的发夹结构。然后，在离心管中分别加入10 μL的 0.5 μmol·L-1H1、0.5 μmol·L-1H2、2.5 μmol·L-1H3、2.5 μmol·L-1H4以及10 μL不同浓度的目标物Tb溶液，37 ℃振荡反应3 h。接下来，继续向各离心管中加入120 μL工作溶液和10 μL 10 μmol·L-1的hemin溶液，置于恒温混匀仪上25 ℃反应1 h。最后，向所得的反应混合液中加入20 μL 5 mmol·L-1的H2O2溶液和10 μL 40 mmol·L-1ABTS溶液，振荡反应4 min后利用紫外可见分光光度计在390～480 nm波长范围内记录吸收光谱，根据其吸光度大小构建Tb定量分析关系。

2 结果与讨论

2.1 均相分析体系设计与传感机制研究

设计了4个发夹DNA H1、H2、H3、H4。其中，H1包含了Tb核酸适配体序列及可与H2互补配对的碱基序列；H3与H4之间可以发生杂交链反应，并且可使序列中两个劈开的G-四链体片段头碰头组装结合形成一个完整的G-四链体DNA酶活性结构[10]。

基于G-四链体DNA酶双向自组装作用的Tb均相比色生物传感机制如图1所示。

图1 基于G-四链体DNA酶双向自组装作用的Tb均相比色生物传感机制示意图Fig.1 Schematic illustration of Tb homogeneous colorimetric biosensing mechanism based on bidirectional self-assembly of G-quadruplexe DNAzymes

当没有目标物Tb时，4个DNA均可保持稳定的发夹构型，从而使得该分析方法具有较弱的背景信号。当Tb存在时，H1可特异性识别Tb并由发夹结构变为线性结构，进而溶液中的发夹H2可通过碱基互补配对原则与上述反应形成的线性单链核酸进行杂交。这样不仅可以通过链置换反应使得Tb竞争释放出来，进一步参与同H1的识别反应从而实现目标物循环，而且由H1和H2杂交产生的双链DNA(dsDNA)前后两端都设计有部分区域可与H3、H4进行碱基序列互补。因此，该反应产生的dsDNA即可作为引物来触发与H3、H4进行双向杂交链反应[9]，从而自组装生成含有大量G-四链体DNA酶活性结构的双向支路核酸结构。

为了验证上述DNA杂交反应的可行性，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分别对相关核酸样品的电泳迁移速率进行了表征，结果如图2所示。

1～7：H1、H2、H1+H2+Tb、H3、H4、H1+H2+H3+H4、H1+H2+H3+H4+Tb

从图2可以看出，与单独的H1、H2、H3、H4相比，它们的混合样品未出现新的迁移带，而H1、H2和Tb混合后出现一个迁移率较低的新的亮带。这一结果不仅说明H1、H2、H3、H4在没有Tb目标物的情况下可在溶液中稳定存在，而且证明了发夹H1可以特异性识别Tb并与H2发生杂交反应形成dsDNA。当将H1、H2、H3、H4与Tb混合后出现了一条迁移速率变慢且具有明显拖尾现象的梯度电泳带，这一结果充分证明了由H1和H2产生的dsDNA可作为H3和H4的引物来成功触发其杂交链反应。

在此基础上，即可利用杂交链反应产物上自组装形成的大量G-四链体DNA酶的优良催化显色反应来进行该方法的方便比色信号转导。为了进一步验证该信号转导策略的可行性，采用紫外可见吸收光谱法考察Tb目标物在上述构建的生物传感体系中的吸光度响应，结果如图3所示。

图3 试剂空白(a)与1 nmol·L-1 Tb(b)的紫外可见吸收光谱(内插图为相应检测溶液的图像)Fig.3 UV-Vis absorption spectra of blank control(a) and 1 nmol·L-1 Tb(b)(the inset shows the photographs of corresponding detection solutions)

从图3可以看出，与试剂空白微弱的吸光度响应相比，1 nmol·L-1Tb在进行生物识别及显色反应后所得的检测产物在420 nm附近出现了一个较强的吸收峰；同时从插图可以看到，该显色产物与试剂空白相比发生了明显的颜色变化。这一结果很好证明了将上述设计的信号转导策略用于Tb比色生物传感检测是可行的。

2.2 均相反应时间优化

为了保证最佳分析性能，同时向反应体系中加入发夹DNA、Tb目标物及hemin溶液均相反应不同时间，考察均相反应时间对1 nmol·L-1Tb吸光度响应的影响，结果如图4所示。

图4 均相反应时间对1 nmol·L-1 Tb吸光度响应的影响Fig.4 Effect of homogeneous reaction time on absorbance response of 1 nmol·L-1 Tb

从图4可以看出，随着均相反应时间的延长，1 nmol·L-1Tb的吸光度响应不断增强；当均相反应时间超过3.0 h后，吸光度响应逐渐趋于一个稳定值。表明，3.0 h可充分实现Tb的均相生物识别、链置换触发杂交链反应以组装形成G-四链体DNA酶活性结构，以及G-四链体DNA酶特异性结合hemin后进行灵敏的催化显色反应。因此，确定Tb比色分析的最佳均相反应时间为3.0 h。

2.3 分析性能评价

在优化条件下，通过设计的信号转导策略比较不同浓度Tb的紫外可见吸收光谱，结果如图5所示。

图5 不同浓度Tb的紫外可见吸收光谱(a)及该方法的校正曲线(b)Fig.5 UV-Vis absorption spectra of different concentrations of Tb(a) and calibration curve of the method(b)

从图5a可以看出，随着Tb目标物浓度的增加(从1 pmol·L-1增至1 nmol·L-1)，其在420 nm附近的吸收峰强度不断增强。从图5b可以看出，在 1 pmol·L-1～1 nmol·L-1浓度范围内，吸光度与Tb目标物浓度的对数值呈良好的线性关系。在信背比为3时，计算得到该方法的检测限为0.82 pmol·L-1，该检测限与文献[3,5,8]报道的几种Tb生物传感方法相比都要低，从而很好证明了该方法的优良分析性能。

2.4 特异性与可靠性考察

分别用HIgG、HSA和BSA等3种非同源蛋白代替Tb，采用相同的信号转导策略考察它们在所构建的生物传感体系中的交叉反应情况，结果如图6所示。

图6 空白对照、100 nmol·L-1 BSA、HSA、HIgG和1 nmol·L-1 Tb的吸光度响应Fig.6 Absorbance responses of blank control,100 nmol·L-1 BSA，HSA，HIgG，and 1 nmol·L-1 Tb

从图6可以看出，与Tb目标物明显的吸光度响应相比，100倍浓度的其它3种非同源蛋白都未产生与空白对照相比明显的吸光度响应。表明，所设计的生物传感体系对Tb目标物具有很高的特异性，该分析方法拥有很好的选择性。

为了考察该生物传感方法的分析可靠性及实际应用前景，将其用于人血清样品中Tb含量的检测。由于在所考察的人血清样品中没有Tb检出，进一步将不同浓度的Tb标准溶液加入其中进行回收实验，得到加标回收率为96.8%～103.2%，5次平行测定结果的RSD<3.2%。表明，将该分析方法用于血清真实样品中Tb检测具有较好的可靠性和准确度。

3 结论

基于高特异性核酸适配体识别及其触发的核酸链置换与杂交链反应来进行G-四链体DNA酶活性结构的双向自组装，成功发展了一种可用于Tb均相分析的比色生物传感新方法。由于链置换反应辅助的目标物循环和杂交链反应引起的双向核酸自组装均极大促进了该DNA酶活性结构的大量形成及其酶催化比色响应信号的放大，使得该方法具很高的分析灵敏度。同时，该方法在均相分析过程中不需要进行多步反应、洗涤、分离操作或使用纳米材料来进行信号放大，操作十分方便，而且还具有优良的重复性，有望在临床诊断领域发挥重要的实用价值。