生脉散对糖尿病大鼠心脏钙转运蛋白的调节作用❋

翟 取，孙明杰，崔海峰，武 乾，石晓路

(中国中医科学院医学实验中心，北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，北京 100700)

糖尿病心肌病(DCM)是独立于心脏微血管病变的原发性心肌损害，主要表现为心脏收缩和舒张功能异常，与心力衰竭的发生密切相关，是糖尿病患者死亡和致残的重要因素[1]。DCM的发生机制包括心肌重构、心肌细胞代谢障碍、氧自由基生成异常、兴奋收缩偶联功能障碍、Ca2+转运异常等[2-4]。研究发现，生脉散可以调节压力负荷型心肌肥厚大鼠肌浆网钙泵功能及Ca2+转运异常[5]，改善DCM造成的心室重构并提高左心室射血分数[6-7]，而针对生脉散影响DCM Ca2+转运机制的研究鲜有报道。因此本实验主要探讨生脉散对糖尿病大鼠心脏收缩功能及心肌Ca2+转运相关蛋白表达量的影响，为DCM的临床治疗提供新参考。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠60只，体质量(160±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006/动物合格证号11400700257071]。饲养于中国中医科学院医学实验中心，温度20～22 ℃，相对湿度40%～60%。本实验已通过中国中医院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会审查。

1.2 实验试剂及主要仪器

链脲佐菌素(美国Sigma公司，货号S-0130)；曲美他嗪 Trimetazidine(施维雅制药)；生脉散(人参、麦冬、五味子组分比例为1∶2∶1，委托吉林天强制药股份有限公司加工为无糖型生脉散溶液，每毫升相当于人参原料 0.1 g，经检测符合2015版本《中国药典》生脉饮制备要求)；One Step Western Kit HRP(康为世纪公司，货号CW2029)；PLB抗体(Abcam公司，货号ab2865)；PLBSer16+Thr17抗体(Abcam公司，货号ab6210)；SERCA2a抗体(Abcam公司，货号ab2861)；NCX1抗体(Abcam公司，货号ab2869)；RyR phospho S2808抗体(Abcam公司，货号ab59225)；CACNA1C抗体(Abcam公司，货号ab84814)；全蛋白提取试剂盒(solarbio公司，货号BC3710-100T)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(solarbio公司，货号PC0020)；Vevo770高分辨率超声影像系统(加拿大Visual Sonics)；Western Blot凝胶电泳系统(美国Bio-Rad公司)；ChemiDoc 凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；罗氏卓越精采型血糖仪(罗氏血糖仪公司)。

2 方法

2.1 造模与分组

60只大鼠适应性1周后，按照体质量随机选出10只作为对照组，实验期间持续采用普通饲料喂养。剩余50只大鼠使用高脂饲料喂养4周(江苏美迪森生物医药有限公司，货号MD12032，45%fat Kcal%)。大鼠禁食8 h，腹腔注射无菌链脲佐菌素柠檬酸钠缓冲液45 mg/kg，之后继续高脂饲料饲养。注射结束后在2周内每3天检测大鼠空腹8 h血糖，血糖值≥16.7 mmol·L-1,并稳定2周即为造模成功。将上述成模大鼠按照体质量、血糖随机分为模型组、曲美他嗪组(TMZ)、生脉散组(SMS)。曲美他嗪组灌胃曲美他嗪7 mg·kg-1·day-1，生脉散组灌胃生脉散溶液(折合人参原料1050 mg·kg-1·day-1)，灌胃给药12周，自给药起计为本研究第0周。对照组和模型组给予等体积等时长的纯净水。

2.2 体质量及血糖检测

定期监测大鼠体质量及空腹8 h鼠尾血糖。

2.3 心脏超声检测心功能

采用Vevo 770高分辨率小动物超声心动检测系统，超声频率17.5 MHz。异氟烷麻醉，于大鼠左侧胸骨旁左室乳头肌水平获取M-mode图像，测量大鼠左心室射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)。

2.4 Western Blot技术检测心肌肌浆网Ca2+转运相关蛋白

大鼠左心室心肌组织提取总蛋白，BCA法定量，依据不同蛋白分子量制备相应分离胶。抗体稀释比例：GAPDH稀释1∶5000，SERCA2a 1∶1000，其余抗体PLB、PLBSer16+Thr17、NCX1、CACNA1C、RyR phosphoS2808稀释比例均为1∶500)，洗膜，ECL发光检测。采用ChemiDoc 凝胶成像分析系统曝光及扫描。Image Lab 软件进行图像分析，结果以内参GAPDH校正。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 生脉散对糖尿病大鼠体质量及空腹血糖的影响

图1、2显示，注射链脲佐菌素(STZ)后大鼠体质量在给药后12周内呈下降趋势。第8、10、12周明显降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。12周内血糖监测显示，与对照组比较，STZ造模后3组大鼠血糖显著增高(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，且给药组与模型组间血糖比较差异无统计学意义。

注：与空白组比较：**P<0.01

注：与空白组比较：**P<0.01

3.2 生脉散对糖尿病大鼠心脏收缩功能影响

为检测生脉散对糖尿病大鼠心脏收缩功能的影响。本实验通过超声心动系统监测给药后12周内大鼠左心室射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)。EF为搏出量占心室末期容积百分比，FS为左室舒张，收缩末期直径之差与舒张末期直径之比。图3 A为各组大鼠在左心室M-mode下第12周超声下心脏收缩形态。结果显示，正常组室间隔及后壁搏动有力，收缩明显；模型组室壁搏动明显减弱，心室内径增大；曲美他嗪组和生脉散组心脏收缩有所改善。图3B、C显示，STZ注射后第4周各组大鼠EF、FS值并无明显差异；伴随糖尿病病程与正常组比较，模型组第8周、12周 EF、FS显著降低(P<0.05，P<0.01)。与正常组比较，生脉散及曲美他嗪给药组第8周EF、FS显著降低(P<0.01，P<0.05)，但与模型组比较有增高趋势。而第12周与模型组比较，2给药组EF、FS显著增高(P<0.05，P<0.05)。

注：A.大鼠在M-Mode下超声心动二维图像;B.各组大鼠EF值 C为各组大鼠FS值。与空白组比较：*P<0.05, **P<0.01；与模型组比较：#P<0.05

注：与对照组比较：*P<0.05, **P<0.01；与模型组比较：#P<0.05, ##P<0.01

3.3 生脉散对心肌肌浆网Ca2+转运相关蛋白的影响

图4示，与对照组比较，STZ注射后糖尿病大鼠左心室心肌组织受磷蛋白(PLB)表达显著增高(P<0.05)；肌浆网钙泵ATP酶(SERCA2a)、磷酸化PLB(PLBSer16+Thr17)、钠钙交换体(NCX1)蛋白表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，表明发挥钙回摄和消除作用的相关蛋白活性减弱。与模型组大鼠比较，曲美他嗪组和生脉散组PLBSer16+Thr17、SERCA2a、NCX1表达显著增加(P<0.05，P<0.01)，表明发挥钙回摄和消除作用的相关蛋白活性增强。各组大鼠雷诺丁受体(RyR)、电压门控钙通道α1C亚基(CACNA1C)表达无差异。

图5示，与对照组比较，糖尿病大鼠SERCA2a/PLB、PLBSer16+Thr17/PLB比值降低表明，SERCA2a活性降低；与模型组大鼠比较，TMZ组和SMS组PLBSer16+Thr17/PLB、SERCA2a/PLB比值增加，表明心肌SERCA2a活性增加。

注：将各组SERCA2a，PLB，p-PLB均值间进行比较：A为SERCA2a与PLB的相对蛋白表达含量及比值; B为PLB Ser16+Thr17与PLB的相对蛋白表达含量及比值

4 讨论

生脉散具有益气滋阴的作用，临床常用其治疗脉微自汗、心悸气短的气阴两虚证。现代临床及药理学研究均表明，生脉散具有保护DCM受损心肌的作用。有研究发现，生脉散可以改善db/db小鼠心脏的舒张功能[8]。也有研究认为，生脉散合丹参汤可以延缓STZ诱导的糖尿病大鼠心室重构[9]，而生脉散对心肌细胞Ca2+转运蛋白的调节作用鲜见报道。

心肌细胞正常的收缩活动基于胞内Ca2+的正常转运。Ca2+通过电压依赖性L型Ca2+通道进入细胞，与肌浆网(SR)上的雷诺丁受体(RyR)结合，RyR开放后大量Ca2+自肌浆网释放到胞浆内与肌钙蛋白结合后引起肌丝滑行和心肌细胞收缩，随着细胞内Ca2+的减少而收缩终止。大鼠心肌舒张期胞质内约90%的Ca2+被肌浆网上Ca2+-ATP酶(SERCA2a)泵回到肌浆网内，其活性与受磷蛋白(PLB)的磷酸化密切相关，PLB磷酸化会增加SERCA2a Ca2+转运能力，去磷酸化则会抑制SERCA2a活性。剩余的Ca2+会通过肌细胞膜上的Na+-Ca2+交换体(NCX1)和Ca2+-ATP酶排出细胞外[10]。当SERCA2a、PLB、NCX表达降低或功能障碍时，心肌细胞内Ca2+无法正常转运，造成Ca2+超载、肌浆网Ca2+储存减少和钙瞬变幅值降低，最终引发心脏机械活动障碍以及心律失常等问题。

以往研究表明，糖尿病状态下小鼠心肌细胞内PLB 表达增加[11]，磷酸化水平下降，对SERCA2a的抑制作用增加，且高糖状态导致SERCA2a表达下降[12-14]，因此将Ca2+泵回肌浆网的能力大大减弱。肌浆网内Ca2+含量减少，钙瞬变幅值减少，导致小鼠心脏收缩功能受损。体内诱导SERCA2a表达增加可以纠正Ca2+处理异常，并改善小鼠收缩功能障碍[15]。晚期糖尿病状态下NCX1的表达与活性降低，泵出细胞外的Ca2+变少，增加其表达可以补偿因SERCA2a活性降低导致的钙瞬变幅值降低，NCX表达减少与糖尿病状态下钙超载密切相关，增加其表达有助于恢复小鼠心功能[16-18]。但也有研究表明，抑制NCX可以抗小鼠心律失常[19]。

在本研究中模型组糖尿病大鼠PLB表达升高；PLB磷酸化水平、SERCA2a、NCX1表达降低，与上述研究较为一致。说明模型组出现心肌细胞钙超载以及钙转运异常，这将导致心肌细胞钙库容量不足及钙瞬变幅值降低，心肌收缩能力受损。本研究超声心动结果显示，糖尿病大鼠左心室射血分数降低以及短轴缩短率降低，印证上述钙转运蛋白改变导致糖尿病大鼠心脏收缩功能发生障碍。本研究发现，生脉散可以显著减少STZ诱导的糖尿病大鼠心肌组织中PLB的过表达，增加PLB磷酸化，增加SERCA2a表达以及SERCA2a/PLBSer16+Thr17、SERCA2a/PLB比值。SERCA2a/PLB可用于评估肌浆网钙泵功能[20]，比值越小证明可以用于将Ca2+回摄入肌浆网的SERCA2a越少。因此生脉散可能通过增加PLB磷酸化、SERCA2a、NCX1的表达，减少舒张期Ca2+超载，同时增加肌浆网内Ca2+储备来保护糖尿病大鼠心脏的收缩功能。此外本实验发现，曲美他嗪组改善SERCA2a表达的作用更为显著。DCM状态下ROS和晚期糖基化产物(AGEs)可扰乱蛋白质折叠，影响心肌细胞内蛋白合成。曲美他嗪是一种3-酮脂酰辅酶A硫解酶抑制剂，可抑制游离脂肪酸氧化的最后一个酶促步骤，增加糖尿病状态下的葡萄糖氧化，将底物利用向葡萄糖转移，减少ROS和AGEs聚集[21]。曲美他嗪有可能通过干预能量底物保护心肌细胞代谢，阻止ATP下降，减少有害氧化产物对蛋白合成的影响，进而影响SERCA2a、NCX1的表达，保护因能量代谢障碍引起的收缩功能障碍。

综上，生脉散可能通过抑制PLB过表达，增加PLB磷酸化、SERCA2a、NCX1表达来增加钙回摄与钙消除，从而保护糖尿病大鼠心脏收缩功能，本研究为DCM的治疗及药物研究提供了理论依据。