基于网络药理学分析藿朴夏苓汤作用机制以探讨新型冠状病毒肺炎的治疗❋

付 畅，赵 勇，谢 敏，肖红慧，李会敏，杨哲昀，左新河，△

(1.湖北中医药大学，武汉 430061；2.湖北省中医院，武汉 430074)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)具有传染性强、流行性广等特点，属于中医学“疫病”范畴[1]。自其发生以来治疗方案得到不断更新，但还没有特效药，目前多采用中西医结合治疗方式，中医药的参与对于改善症状、防止恶化、促进康复等起到重要作用[2]。COVID-19以发热、干咳、乏力为主要表现，初期患者中可见纳呆呕恶、大便黏腻不爽、苔白厚或白腻等湿浊之象[3]。熊继柏[4]认为此乃邪犯胃肠所致，可以运用藿朴夏苓汤进行治疗。藿朴夏苓汤由广藿香、厚朴、半夏、茯苓、苦杏仁、薏苡仁、豆蔻、猪苓、淡豆豉、泽泻、通草等芳香化湿、苦温燥湿、淡渗利湿药物组成，具有宣通肺气、健脾化湿、通利小便之效，在湿温发热中得到运用，取得了良好疗效[5]。藿朴夏苓汤在多个新型冠状病毒肺炎诊疗方案中被推荐使用，在四川省中医药管理局开展的《医院制剂“新冠2号、3号”推广暨临床疗效评价研究》科研应急专项中，“新冠2号”是由银翘散合藿朴夏苓汤加减而成，“新冠3号”也是由荆防败毒散合藿朴夏苓汤加减而成[6]。故本研究拟采用网络药理学方法，分析藿朴夏苓汤的组方成分、靶点及潜在作用机制，探讨其对COVID-19的治疗作用，为进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 藿朴夏苓汤活性成分筛选

本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，依次以藿朴夏苓汤的组成广藿香、厚朴、半夏、茯苓、苦杏仁、薏苡仁、豆蔻、猪苓、淡豆豉、泽泻、通草等为关键词进行检索，并设置口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为条件进行筛选，得到各味中药的活性成分。

1.2 活性成分靶点的获取及药物-成分-靶点网络的构建

通过TCMSP获取活性成分对应的靶点，使用Uniport数据库(https://www.uniprot.org)设置物种为人，将得到的靶点名称转换为对应的基因名称，使用Cytoscape 3.6.0软件构建药物-成分-靶点网络图。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及关键靶点筛选

将获取的藿朴夏苓汤组方药物活性成分靶点输入到STRING数据库(https://string-db.org)进行靶点PPI分析，将PPI数据导入到Cytoscape 3.6.0软件构建网络，并运用MCODE及CentiScaPe插件进行模块化、拓扑学分析，筛选关键靶点。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将筛选的关键靶点导入到DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并用在线绘图网站Omicshare(https://www.omicshare.com)将得到的结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 藿朴夏苓汤活性成分及靶点

通过TCMSP获取到符合筛选条件的藿朴夏苓汤活性成分，其中查询到靶点的活性成分为广藿香9种，厚朴2种，半夏12种，茯苓7种，苦杏仁16种，薏苡仁6种，豆蔻12种，猪苓7种，淡豆豉1种，泽泻7种，通草3种，合并后共有71种不同成分对应235个靶点。

2.2 藿朴夏苓汤药物-成分-靶点网络图

图1示，运用Cytoscape 3.6.0软件构建药物-成分-靶点网络图，网络中共有316个节点1146条边，包含11个药物71个成分235个靶点。按节点度值排序，排名在前的活性成分有槲皮素、豆甾醇、木犀草素、黄芩素和β-谷甾醇等成分。

图1 药物-成分-靶点网络图

2.3 PPI网络的构建及关键靶点筛选

图2示，将藿朴夏苓汤作用的235个靶点导入STRING数据库进行PPI分析。运用Cytoscape 3.6.0软件处理，在网络中有231个节点4164条边。图3示，使用MCODE插件对网络进行模块化分析，设定K-Core为4，得到4个模块K-Core大于4。其中模块1得分46.677分，包含63个节点1447条边；模块2得分13.000，包含13个节点78条边；模块3得分5.714分，包含8个节点20条边；模块4得分5.385分，包含27个节点70条边。表1示，运用CentiScaPe插件对网络进行拓扑学分析，网络中度平均值36.052，中介中心性平均值248.442，紧密中心性平均值为0.002，筛选得到41个关键靶点。

图2 靶点PPI图

图3 PPI网络MCODE模块化图

2.4 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

图4、5示，运用DVAID对筛选的关键靶点进行GO功能富集分析(P<0.05)，得到72个条目，其中生物过程44条，细胞组成7条，分子功能21条，按P值排序前20条。对筛选的靶点进行KEGG通路富集分析(P<0.05)，得到73个信号通路，按P值排序前20条。

表1 靶点网络拓扑数据比较

图4 GO功能富集分析气泡图

图5 KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引发的疾病。SARS-CoV-2属于β型冠状病毒[7]，它能通过其表面的棘突蛋白与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合而进入到细胞中[8]。SARS-CoV-2棘突蛋白与ACE2受体的结合下调ACE2的表达，导致血管紧张素Ⅱ水平升高，血管紧张素Ⅱ通过结合其受体Ⅰ型和Ⅱ型发挥血管活性作用，增加肺血管通透性，诱导急性肺损伤[9]。研究发现，ACE2受体除在Ⅱ型肺泡上皮细胞和呼吸道上皮细胞高表达外，还在心肌细胞、肾近曲小管上皮细胞、膀胱上皮细胞、食道和回肠上皮细胞均有表达[10]，提示SARS-CoV-2对心脏、肾脏等其他器官也具有杀伤力。COVID-19除引起典型的呼吸系统症状外，对心血管、消化、泌尿系统也都有影响，能造成多脏器衰竭，严重者导致死亡[11-12]。

通过网络药理学分析发现，藿朴夏苓汤的11味中药含有71种活性成分，在网络中度值高的活性成分有槲皮素、豆甾醇、木犀草素、黄芩素、β-谷甾醇等成分。槲皮素、木犀草素、黄芩素为黄酮类化合物。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫调节的作用[13]，实验发现其能够降低脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠TNF-α、IL-6水平，抑制过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性，即通过抑制炎症与氧化应激的方式来防治急性肺损伤[14]，同时槲皮素对心脏也有保护作用[15]。木犀草素在体内外具有很强的抗炎活性[16]，能够减少MAPL和NF-κB途径的激活，抑制ICAM-1、TNF-α分泌，减弱肺部炎症反应[17]；木犀草素对于甲型流感病毒诱导的肺内皮屏障功能障碍也有改善作用，能够降低过高的肺通透性[18]。黄芩素具有抗菌、抗病毒的作用，能够降低TNF-α、IL-6、MCP-1水平，增高IFN-γ、IL-10水平，从而治疗甲型流感病毒诱导的急性肺损伤[19]。豆甾醇、β-谷甾醇都是植物甾醇类化合物，豆甾醇能减少嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的增殖，减轻细支气管、肺泡炎性细胞的浸润[20]。β-谷甾醇能够抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞上皮-间质转化，具有抗肺纤维化的作用[21]。

藿朴夏苓汤的作用靶点PPI网络模块化分析结果显示，其主要涉及4个模块。免疫细胞大量分泌细胞因子及趋化因子，能够导致细胞因子风暴的启动[22]，模块1中的靶点包含促炎性因子TNF、IL-1B、IL-2、IL-6[23-24]，趋化因子CCL2、CXCL8、CXCL10[25]及抗炎性因子IL-4、IL-10[26-27]，通过对其调节能够改善体内的细胞因子风暴。MMP2、MMP3、MMP9等基质金属蛋白酶在白细胞的迁延中起重要作用，能够介导细胞因子的分泌，加剧细胞因子风暴[28]。细胞因子风暴还能加剧肺组织上皮细胞和肺血管内皮细胞损伤，EGF、EGFR、VEGFA等生长因子能够促进细胞增殖，加之VCAM1的黏附作用有助于内皮屏障的重建，改善急性肺损伤[29]。PPARG能够改善流感病毒诱导的细胞因子风暴中炎症反应[30]；模块2的靶点主要为阿片受体、乙酰胆碱受体、多巴胺受体等。阿片类受体激动能够减轻脂多糖诱导的肺损伤，改善急性呼吸窘迫综合征[31]。乙酰胆碱受体功能的降低会增加乙酰胆碱的释放和气道高反应性，加强炎症因子的刺激[32]。多巴胺受体激动能够通过抑制YAP/TAZ治疗肺纤维化[33]；模块3的靶点主要为肾上腺素能受体、胺氧化酶。肾上腺素能受体激动能够抑制炎性因子经气道释放，减轻肺部炎症，改善肺组织微循环障碍[34]。胺氧化酶能够调节白细胞滚动速度及迁移效率，减缓肺纤维化损伤[35]；模块4的靶点包含多种酶与转录因子，能够参与细胞周期的调控。

关键靶点的GO功能富集分析显示，生物过程涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控、脂多糖介导的信号通路、DNA模板转录的正调控、脂多糖的细胞反应、炎症反应、蛋白激酶B信号传导等，细胞组成涉及核质、顶端质膜等，分子功能涉及转录因子结合、蛋白磷酸酶结合、染色质结合、转录调控区DNA结合、血红素结合、转录激活RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性结合活性等。KEGG通路富集分析显示，涉及甲型流感、百日咳、非小细胞肺癌等疾病通路，肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等信号通路。SARS-CoV-2作为RNA病毒，通过调控RNA聚合酶II启动子的转录，能够影响病毒RNA的复制[36]。脂多糖是常见的炎症触发因素[37]，能够引起内皮细胞凋亡，诱发肺组织炎症、肺间质水肿，出现呼吸困难和低氧血症造成急性肺损伤[38]，因此通过对脂多糖相关因素的调控，能够改善肺炎症反应及减少肺损伤。通路富集分析发现，前20条通路中肺相关疾病的条目较多,显示靶点对肺相关疾病的作用较明显。Toll样受体作为信号分子模式识别受体，主要参与非特异性免疫，是对抗病毒的第一道防线，其还参与肺纤维化的发生发展[39]。NOD样受体信号通路同样作为机体固有免疫系统的一部分，参与免疫应答，介导炎症反应[40]。肿瘤坏死因子信号通路是炎症反应中的重要通路，对抑制细胞因子风暴起着重要作用[41]。HIF-1信号通路在机体低氧的应答中起重要作用，能够改善缺氧表现[42]，对于该信号通路的调控还能抑制肺纤维化[43]。MAPK信号通路在急性肺损伤、肺纤维化进程中也起到调节作用[44-45]。

综上所述，本次研究通过网络药理学分析发现，藿朴夏苓汤通过多成分、多靶点发挥着抗炎、免疫调节、抗肺纤维化的作用，通过肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、HIF-1信号通路等多通路起到对COVID-19的治疗作用，这为藿朴夏苓汤更广泛地应用于治疗COVID-19提供了理论依据。