红景天苷对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞的保护作用❋

冯 闯，左中夫，刘文强，刘学政△

(1.辽宁中医药大学，沈阳 110847；2.锦州医科大学，辽宁 锦州 121001)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)状态下Müller细胞受损会导致细胞外谷氨酸异常增加，从而激活谷氨酸受体，引起视网膜损伤[1]，因此保护受损伤的Müller细胞尤为重要。红景天苷为植物红景天的提取物，现代医学已经确认其具有抗炎、降血糖、调血脂等作用。近年来还发现，其具有很强的神经保护作用[2], 从而被广泛应用于糖尿病及其并发症的治疗中[3-4]，但其对DR的影响及作用机制目前尚不明确。因此，本研究欲观察红景天苷是否对糖尿病早期大鼠Müller细胞的损伤具有神经保护作用，为其对DR的临床应用及新药研发提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

雄性SD大鼠56只，体质量 180～220 g，购自锦州医科大学实验动物中心(SCXK(辽)2014-16)。本实验通过锦州医科大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 试剂及仪器

链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，美国Sigma公司；红景天苷，大连美仑公司；神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GS)、甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde dehydrogenase, GAPDH)一抗，英国Abcam公司；谷氨酸含量检测试剂盒、荧光二抗及Western blot二抗，北京碧云天公司；荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；冰冻切片机，德国SLEE公司；水平电泳仪：美国BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 模型制备及给药方法

大鼠正常饮食3 d后，隔夜禁食水，配制1.5 g·L-1STZ溶液(50 mg·kg-1)腹腔给药。给药3 d后尾静脉血糖检测，将大于16.7 mmol·L-1的大鼠作为糖尿病模型。按随机数字表法将糖尿病大鼠分为糖尿病组、红景天苷组及二甲双胍组(阳性对照)3组各14只，另取14只正常大鼠作为对照组。红景天苷组给予红景天苷灌胃治疗(200 mg·kg-1)[3]，每日2次，二甲双胍组给予二甲双胍(20 mg·kg-1·d-1)[5]。对照组、糖尿病组等剂量PBS缓冲液灌胃，1个月后进行各项指标检测。

2.2 样本制备

1个月后每组取4只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定取出大鼠眼球于固定液中，用于免疫荧光。每组4只大鼠麻醉后取视网膜于2.5 ml EP管内裂解，冰上剪碎，4 ℃离心机25 min后取上清，-20 ℃保存用于Western blot。另外每组取6只大鼠检测谷氨酸含量。

2.3 视网膜谷氨酸含量检测

取视网膜于1.5 mL离心管内，5000 r/min离心后弃上清，蒸干再加入100 μL H2O及50 μL衍生剂孵育20 min，再加入250 μL样品稀释液，取20 μL进样，详细步骤严格按照说明书进行，按照蛋白浓度计算谷氨酸含量。

2.4 免疫荧光检测视网膜GFAP、GS表达

眼球经30%蔗糖脱水，OCT包埋切片10 μm。载玻片于 PBS洗涤3次；3%山羊血清+0.3% Triton-100室温孵育1 h；不洗，滴加兔抗大鼠GFAP(1∶300)、兔抗大鼠GS(1∶400)，4 ℃过夜；PBS洗涤4次；滴加二抗，室温1 h；PBS洗涤4次；封片后荧光显微镜观察。

2.5 Western blot检测视网膜GFAP、GS相对表达量

BCA法检测蛋白浓度，确定电泳时加入15 μL样品；电泳、转膜后1% BSA室温封闭2 h；加入一抗(兔抗大鼠GFAP，1∶5000；兔抗大鼠GS，1∶10000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤4次，加入二抗室温2 h，孵育后TBST洗涤4次，ECL显影，Image J软件分析灰度值。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠血糖变化及糖尿病模型的建立

表1示，造模前各组血糖之间总体差异无统计学意义(P> 0.05)。造模后与对照组比较，后3组血糖均大于16.7 mmol·L-1，说明造模成功；与糖尿病组比较，红景天苷组血糖有所下降，但仍高于正常(P<0.01)，二甲双胍组血糖明显下降至正常(P<0.01)。

表1 各组大鼠血糖变化比较

注：与对照组比较：△△P<0.01；与糖尿病组比较：☆☆P<0.01

3.2 视网膜谷氨酸含量变化

表2示，与对照组比较，糖尿病组谷氨酸含量明显升高(P<0.01)。与糖尿病组比较，红景天苷组及二甲双胍组谷氨酸含量明显下降，且二甲双胍组下降更明显(P<0.01)。

3.3 免疫荧光检测GFAP、GS表达

图1表3示，将对照组GFAP、GS荧光强度设定为100.00%，与对照组比较，糖尿病组GFAP荧光强度有所升高，GS荧光强度明显下降(P<0.01)。与糖尿病组比较，红景天苷组GFAP、GS荧光强度明显升高(P<0.01)。

表2 各组大鼠谷氨酸含量比较

注：与对照组比较：△△P<0.01；与糖尿病组比较：☆☆P<0.01

3.4 Western blot 检测GFAP、GS表达

图2表3示，与对照组比较，糖尿病组GFAP表达有所升高，GS表达明显下降(P<0.01)。与糖尿病组比较，红景天苷组GFAP、GS荧光强度明显升高(P<0.01)。

4 讨论

尽管微血管损伤为DR不可或缺的一部分，但神经损伤亦参与DR的发展进程，且损伤发生于血管病变之前[6]。DR状态下Müller细胞损伤会引起谷氨酸异常增加，从而对视网膜造成毒性作用，因此保护受损伤的Müller细胞尤为重要。

表3 免疫荧光及Western blot检测各蛋白表达比较

注：与对照组比较：△△P<0.01；与糖尿病组比较：☆☆P<0.01

注：A.对照组；B.糖尿病组；C.红景天苷组；D.二甲双胍组

众多学者对红景天苷进行了大量实验[7-8]。实验已经确认，红景天苷抗炎、降血糖、调血脂等作用突出。近年来还发现，其具有很强的神经保护作用，对糖尿病等疾病的治疗效果明显，但对DR状态下Müller细胞损伤的影响尚不清楚。Shih-Yu Lee等在体外和体内实验均证实，红景天苷可激活AMPK信号对抗肝脏糖异生途径进而降低血糖[9]。而鞠霖杰等证实，红景天苷可保护胰岛β细胞，从而实现降低血糖的作用[10]。这与本研究结果相一致。

Müller细胞功能异常可引起DR神经损伤[11]。GFAP为Müller细胞标志物，但视网膜功能正常时几乎不表达GFAP，当Müller细胞出现病理损伤时视网膜GFAP表达增加[12]。本研究显示，对照组节细胞层内GFAP微量表达，但DR时其他部位也出现GFAP弱表达，这可能为Müller细胞活化对自身损伤的反应。而红景天苷治疗后视网膜全层均可见GFAP阳性表达，阳性分布趋势与Müller细胞走向一致。该结果提示，红景天苷在DR状态下可有效上调视网膜GFAP的表达。

GS表达于Müller细胞内，可对分解谷氨酸从而减轻谷氨酸堆积对视网膜的损伤[13]，可见GS对视网膜功能的稳定尤为重要[14]。本实验结果显示，DR状态下GS的表达明显下降，伴随谷氨酸含量的增加，说明Müller细胞已经受到一定的损伤，清除谷氨酸的功能下降。而应用红景天苷后，GFAP的表达明显增加，GS的表达亦有所增加，同时谷氨酸含量得到一定的清除。有学者证实，白藜芦醇可上调GS的表达进而能预防视网膜功能障碍[15]。而上调视网膜谷氨酸转运体(glutamate transporters, GLAST)的表达，对谷氨酸进行有效的清除，可防止视网膜神经细胞的凋亡[16]。因此，本研究推测红景天苷可能通过上调GFAP、GS表达及降低谷氨酸含量，对DR状态下Müller细胞起到一定的神经保护作用。

综上所述，本研究发现红景天苷可通过降血糖及上调视网膜GFAP、GS表达及降低谷氨酸含量，对DR状态下Müller细胞起到一定的神经保护作用。但因DR发病机理繁多，红景天苷对DR的影响可能与多种信号通路有关，红景天苷对DR的治疗作用需多项研究验证。