喜炎平与头孢唑林钠联用对感染小鼠中性粒细胞凋亡的影响

熊南燕，刘晓霞*，陈剑华，李卫霞，郭旭丽，王雪玲，霍忠超

(1.河北工程大学医学院，河北 邯郸 056038;2.河北工程大学附属医院)

抗生素自问世以来在感染性疾病的治疗方面发挥了很重要的作用，但随着抗生素的使用，耐药菌株逐渐增多，抗生素的疗效逐渐降低。为了改善此现状，临床上常将一些具有清热解毒作用的中药制剂与抗生素联合应用治疗感染性疾病，喜炎平即为常用中药制剂之一。临床上已将喜炎平注射液与阿奇霉素[1]、左氧氟沙星[2]、克林霉素[3]、头孢哌酮[4]、头孢曲松[5]等抗生素联合治疗呼吸道感染、扁桃体炎、化脓性中耳炎等感染性疾病，发现其效果显著，能提高临床有效率。本研究将喜炎平注射液与头孢唑林钠联合应用于金葡球菌感染小鼠，探讨其对中性粒细胞凋亡的影响及机制，为中药制剂与抗生素联合应用提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 菌株金葡菌敏感菌株(26001-25)、金葡菌标准菌株(ATCC25923)购自北京药品生物制品检定所。

1.2 药品与试剂头孢唑林钠(中诺药业，国药准字H13020765，1 g/支)，喜炎平注射液(江西青峰，国药准字Z20026249，规格2 mL∶50 mg)；小鼠中性粒细胞分离液(天津灏洋)、红细胞裂解液(天津灏洋)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天)； 小鼠IL-6、IL-10检测试剂盒(南京森贝伽)；小鼠sFas 检测试剂盒(泉州睿信生物)。

1.3 动物造模及分组昆明小鼠70只，体重17-23 g，雌雄各半。于造模前1天，间隔1 h，经小鼠直肠测体温2次，选择体温(36.5±0.2)℃，两次体温相差不超过0.2℃的小鼠65只。于造模当天每只入选小鼠腹腔注射金葡菌(9×108/mL)0.2 ml， 1 h后，经直肠测量体温，选择体温高于37.2℃的小鼠60只，根据体温编号，并随机分为模型组、头孢唑林钠组、喜炎平组及头孢唑林钠+喜炎平组，每组15只；另选15只体温正常小鼠，腹腔注射PBS，作为对照组。于造模当日，各组小鼠均经腹腔按体重给药，每日2次，对照组和模型组给予生理盐水(70 mg/kg)；头孢唑林钠组给予头孢唑林钠(70 mg/kg)；喜炎平组给予喜炎平注射液(13 mg/kg)；头孢唑林钠+喜炎平组给予头孢唑林钠(70 mg/kg)和喜炎平注射液(13 mg/kg)；共给药7天。

1.4 小鼠中性粒细胞和血浆分离分别于给药第1、4、7天，经心脏采血约1.5 ml，抗凝，每次5只小鼠。0.5 ml抗凝血用于分离中性粒细胞，操作步骤严格按说明书进行，取中性粒细胞层，裂解红细胞，洗涤，台盼蓝检测细胞活力(>95%)。余抗凝血离心分离血浆备用。

1.5 中性粒细胞凋亡检测取2×105/mL中性粒细胞用冰PBS洗涤2次，弃上清，加入Annexin V-FITC结合液195 μl，重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5 μl，混匀，加入PI 10 μl，混匀，室温避光孵育15 min，孵育过程中重悬细胞2次，流式细胞仪检测。

1.6 血浆IL-6、IL-10和sFas检测取1.4中制备的血浆，采用ELISA法检测血浆IL-6、IL-10和sFas含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 各组中性粒细胞凋亡率比较由流式细胞仪检测结果可知，用药第1天，各组间中性粒细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05)；用药第4天和第7天，与对照组相比，模型组凋亡率显著降低(P<0.05)，头孢唑林钠组无显著变化(P>0.05)，喜炎平组和头孢唑林钠+喜炎平组显著升高(P均<0.05)；与模型组相比，头孢唑林钠组、喜炎平组和头孢唑林钠+喜炎平组凋亡率显著升高(P均<0.05)，且喜炎平组凋亡率显著高于头孢唑林钠组(P<0.05)，二者联合用药组的凋亡率显著高于各自单用药组(P均<0.05，表1、图1)。

2.2 各组血浆IL-6水平比较ELISA结果显示，用药第1天，与对照组相比，其他4组血浆IL-6水平显著升高(P均<0.05)，而该4组之间无显著性差异(P>0.05)。用药第4天，与对照组相比，其他4组IL-6水平均显著升高(P均<0.05)，与模型组相比，其他3组IL-6水平显著降低(P均<0.05)，且喜炎平组显著低于头孢唑林钠组(P<0.05)，二者联合用药组显著低于各自单用药组(P均<0.05)。用药第7天，模型组、头孢唑林钠组和喜炎平组IL-6水平与对照组相比均显著升高(P均<0.05)，但头孢唑林钠+喜炎平组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；与模型组相比，其他3组IL-6水平显著降低(P均<0.05)，且喜炎平组显著低于头孢唑林钠组(P<0.05)，二者联合用药组显著低于各自单用药组(P均<0.05)。模型组随着感染时间的延长，第4天和第7天IL-6水平均显著降低(P均<0.05)；其他3个用药组，也随着用药时间的延长，第4天和第7天IL-6水平显著降低(P均<0.05，表2)。

表1 各组中性粒细胞凋亡率比较(%)

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与头孢唑林钠组相比，&P<0.05；与喜炎平组相比，△P<0.05

注：A：对照组；B：模型组；C：头孢唑林钠组；D：喜炎平组；E：头孢唑林钠+喜炎平组

表2 各组血清IL-6水平比较(ng/L)

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与头孢唑林钠组相比，&P<0.05；与喜炎平组相比，△P<0.05。与第1天相比，aP<0.05；与第4天相比，bP<0.05

2.3 各组血浆IL-10水平比较用药第1天，与对照组相比，其他4组血浆IL-10水平显著升高(P均<0.05)，但该4组之间无显著性差异(P>0.05)。用药第4天和第7天，与对照组相比，其他4组IL-10水平均显著升高(P均<0.05)，与模型组相比，其他3组IL-10水平显著升高(P均<0.05)，且喜炎平组显著高于头孢唑林钠组(P<0.05)，二者联合用药组显著高于各自单用药组(P均<0.05)。模型组随着感染时间的延长，第4天和第7天IL-10水平均显著降低(P均<0.05)；而头孢唑林钠组、喜炎平组和头孢唑林钠+喜炎平组，用药第4天和第7天IL-10水平显著高于第1天，但各组在该两个时间点之间无显著性差异(P>0.05，表3)。

表3 各组血清IL-10水平比较(ng/L)

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与头孢唑林钠组相比，&P<0.05；与喜炎平组相比，△P<0.05。与第1天相比，aP<0.05

2.4 各组血浆sFas水平比较用药第1天、第4天和第7天，模型组、头孢唑林钠组、喜炎平组和头孢唑林钠+喜炎平组血浆sFas水平显著高于对照组；但该4组在同一时间点，彼此之间无显著性差异(P均>0.05)，且该4组中，各组不同时间点之间亦无显著性差异(P均>0.05，表4)。

表4 各组血浆sFas水平比较(μg/L)

注：与对照组相比，*P<0.05

3 讨论

中性粒细胞(neutrophils)是机体非特异性抗感染免疫的第一道防线[6]，其主要存在于血液中，不仅能吞噬清除血液中的细菌，还可在趋化因子的作用下，通过趋化运动从血液进入到组织对细菌进行吞噬，并通过胞内杀菌机制和脱颗粒达到清除细菌的目的。此为非特异性过程，中性粒细胞在消灭细菌的同时，也会对自身组织造成损伤[6]，及时清除中性粒细胞是炎症减弱的关键。凋亡是中性粒细胞安全清除的有效方式，其凋亡后可被巨噬细胞完整吞噬[7]，不再释放酶性物质，减少对机体的损伤，故其凋亡在炎症的发展和转归中发挥关键作用。鉴于目前临床上常将中药制剂与抗生素联合用于感染性疾病的治疗，为了寻找联合用药的机制，本研究观察了喜炎平与头孢唑林钠联合应用对中性粒细胞凋亡的影响。结果发现，感染后小鼠中性粒细胞凋亡率降低，提示出现凋亡延迟现象。杨帆[8]进行体外研究认为金葡菌可促进奶牛中性粒细胞凋亡，与本研究结果不相符，可能与本研究为体内实验，受复杂内环境的影响有关。本研究结果还显示，头孢唑林钠单用可促进中性粒细胞凋亡，但仍低于正常水平，而喜炎平单用、喜炎平与头孢唑林钠联合应用可使其凋亡率大大提高，甚至高于正常水平，联合用药提高更显著。李洪涛等[9]发现北五味子多糖可促进健康人中性粒细胞凋亡，赖晓敏[10]发现加味四君子汤可促进严重烫伤大鼠中性粒细胞凋亡；与本研究结果一致，提示中药相关药物能够促进中性粒细胞凋亡。

中性粒细胞凋亡过程受多种因素调节[11]，其中细胞因子就是影响因素之一，因其种类繁多，对中性粒细胞凋亡既可抑制，也可促进。IL-6和IL-10分别是体内有效的内源性促炎因子和抗炎因子，韩露等[12]发现IL-6可延迟中性粒细胞凋亡，发挥抑制作用；Hofman[13]认为IL-10能加速LPS激活的中性粒细胞凋亡。本研究将IL-6和IL-10作为观察对象，发现小鼠感染后，血浆IL-6和IL-10水平均升高，但随感染时间延长，其水平逐渐降低，杨明等[14]认为金葡菌经血流感染小鼠，血清IL-6和IL-10水平分别在感染后12 h和3 h达高峰，之后逐渐降低，这一变化趋势与本研究一致。头孢唑林钠、喜炎平及二者联合用药均可显著降低IL-6水平，且在给药期限内，用药时间越长，降低程度越大；头孢唑林钠与喜炎平联合用药降低效果更显著，用药结束基本达到正常水平。而对于IL-10，各用药组均能显著提高其水平，但单用头孢唑林钠提高IL-10水平能力较单用喜炎平组和二者联用效果略差，二者联合用药提高IL-10的能力最显著；各用药组在用药第4天血浆IL-10水平高于用药第1天，用药第7天与第4天无差异，提示各种用药方式对血浆IL-10水平的提高作用受用药时间影响不明显。提示喜炎平与头孢唑林钠联合应用可能通过降低IL-6水平、提高IL-10水平来促进中性粒细胞凋亡。李洪涛[9]认为北五味子多糖可以通过降低IL-6表达促进中性粒细胞凋亡，Yang[15]研究发现特定抑制剂对SHP-2抑制后可通过提高IL-10水平促进中性粒细胞凋亡，与本研究结果相符。

此外，中性粒细胞还可通过Fas/FasL信号途径介导凋亡，血浆中分泌型Fas(sFas)对该途径有竞争抑制作用，从而也抑制中性粒细胞凋亡[11]。本研究发现，金葡菌感染后小鼠血浆sFas水平显著升高，随感染时间的延长，其水平有增高趋势，但无显著性差异，提示sFas可能参与了中性粒细胞凋亡延迟。Huttunend等[16]也发现菌血症时，血清sFas水平升高；郦珊珊[17]的研究结果显示血浆sFas水平越高，中性粒细胞凋亡率越低。但关于治疗措施对sFas的影响还未见报道。本研究显示头孢唑林钠、喜炎平及喜炎平与头孢唑林钠联合应用对血浆sFas水平无显著影响。

综上所述，喜炎平与头孢唑林钠联合应用能促进金葡菌感染小鼠的血浆中性粒细胞凋亡，能降低血浆IL-6水平、提高IL-10水平，对血浆sFas水平无显著影响。故认为喜炎平与头孢唑林钠联合应用可能通过调节IL-6和IL-10水平，来促进中性粒细胞凋亡，从而减轻炎症反应，改善患者症状，这可能是二者联合用药治愈疾病的机制之一。