一株毒死蜱降解菌的分离与鉴定

齐芬芳 张金霞 牛熙

摘要：本研究从受毒死蜱污染的农田中取样，分离得到一株毒死蜱高效降解菌株，该菌株最高能够耐受1000mg·L^-1浓度的毒死蜱，72h对浓度100mg·L^-1毒死蜱的降解率为52.34%。通过形态学、生理生化和分子学方法对该菌株进行鉴定，确定为枯草芽孢杆菌。

关键词：毒死蜱;降解菌;分离;鉴定

自有机氯农药在我国限用之后，有机磷农药（organo-phosphorus pesticides，OPs）就成为生产及推广使用最多的一种农药，该农药在环境中降解快、残毒低，而且具有成本低、药效高、种类多、药害小、选择性高、治理范围广、比有机氯农药容易降解等优点。但有机磷农药在土壤、水体、植物和动物体内残留，可随着食物链的富集进入人体，从而影响人类健康。研究有机磷农药降解对于保护环境、促进人们健康具有重要意义。

1971年，首次有研究表明，微生物可降解OPs，由于杀虫剂二嗪农的生物降解，有害病虫褐飞虱的控制效率有所下降。继而研究者通过富集、驯化、分离的纯培养方法，筛选出多种能够降解OPs的微生物，包括细菌、真菌、放线菌和藻类等，并对农药的降解途径以及代谢方式进行了研究。目前，农药的微生物降解是指利用微生物的代谢过程使农药的化学结构发生改变，使其由有害的大分子化合物降解为无害的小分子化合物，直至CO₂、H₂O，实现无害化降解的过程，具有降解速度快、降解效果彻底、环境影响小、处理成本低等特点。微生物降解作为一种高效清除农药污染环境生物技术和目前降解OPs的主要手段，已成为OPs降解的研究热点。

本研究以毒死蜱作为目标降解物，从自然环境中分离筛选高效降解菌株，为有机磷农药微生物降解的进一步研究提供菌种资源和理论依据。

一、材料与方法

（一）土壤样品

土壤样品采集于贵阳市某农田。采样深度为510cm。

（二）主要培养基及试剂

1、培养基。LB培养基：胰蛋白胨10g·L^-1;NaCl10g·L^-1;酵母粉5g·L^-1;H₂O1000mL（pH7.0）。如为固体平板则加入1.5%的琼脂。将药品倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌使其完全溶解，用1mol·L^-1的NaOH调节pH值在7.0，再分装至250mL三角瓶中，至高压灭菌锅中灭菌后使用。

毒死蜱无机盐培养基：K₂HPO₄1.5g·L^-1;KH₂PO₄0.5g·L^-1;（NH₄）₂SO₄1.0g·L^-1;NaCl 1.0g·L^-1;Mg-SO₄.7H₂O 0.05g·L^-1;H₂O 1000mL（pH7.0）。农药按需添加，如为固体平板培养基则加入1.5%的琼脂。配置好后121℃灭菌20min备用。

2、主要试剂。毒死蜱原药购自特安源生物科技公司;40%毒死蜱购自浙江东风化工有限公司;无水乙醇、二甲苯、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、石油醚、过氧化氢、氢氧化钠、肌酸等常规试剂均为国产分析纯。琼脂糖凝胶回收试剂盒由天根生化科技（北京有限公司）生产;引物由赛默飞世尔科技公司合成。

（三）菌株的富集与初筛

称取土样3g于毒死蜱无机盐培养基中，在37℃摇床120r·min^-1培养5d，再以10%接种量转入新鲜的毒死蜱无机盐培养基中，培养基中毒死蜱浓度（mg·L^-1）为0、50、100、200。將最后一次培养液取样进行梯度稀释，涂布于毒死蜱无机盐琼脂平板，于37℃恒温培养箱中培养。待长出单菌落时，挑取同批相比较大单菌落于添加50mg·L^-1毒死蜱的LB普通琼脂平板上连续划线5次纯化菌落，直到菌落表面颜色、质地等形态特征完全一致，显微镜下进一步确定纯种，对所得降解菌株进行保种。将纯化菌株接种于100mg·L^-1的毒死蜱无机盐培养基中，梯度增加毒死蜱浓度至1000mg·L^-1，筛选高效降解菌株。

（四）高效降解菌株的筛选

1、标准曲线的制定。根据毒死蜱在波长为292nm时有紫外特殊吸收峰的特性，通过分光光度法来确定在波长为292nm时样品的吸光值。以石油醚为溶剂，配制1000mg·L^-1的毒死蜱母液。再根据需要稀释成浓度（mg·L^-1）为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200的待测溶液。以石油醚为空白对照，采用紫外分光光度计在波长为292nm时测定吸光值，记录毒死蜱浓度和对应的吸光值，重复三次。然后以毒死蜱浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制毒死蜱的标准曲线，求得回归方程和R²。

2、降解菌种子培养液的制备。在LB液体培养基中富集筛选出的高耐药性菌株，当菌液达到对数增长期时，吸取1.5mL培养液至离心管中，以10000r·min^-1离心1min收集菌体，用0.9% NaCl洗涤，分别悬浮于无机盐液体培养基中。

3、降解菌降解率测定。将毒死蜱母液稀释成100mg·L^-1，过滤除菌，加入到100mL灭菌无机盐培养基中。以10%的接种量将种子液加入到100mg·L^-1毒死蜱无机盐培养基中37℃120r·min^-1培养3d，以未加菌的毒死蜱无机盐培养基作为空白对照，培养好的菌液为待测样品。每处理重复三次。取待测液体培养基50mL，加石油醚50mL，振荡4min，静置分层;重复提取两次，合并两次提取液后吸取上清液用紫外分光光度计测取其OD292值，根据标准曲线得出培养液中毒死蜱的质量浓度，计算毒死蜱的降解率，以确定高效降解菌。降解效率公式为：

（五）高效降解菌株的鉴定

1、形态学鉴定。将菌株划线于LB琼脂平板上，37℃培养箱中培養16h，挑取单菌落进行革兰氏染色，镜下观察菌体。

2、生理生化鉴定。参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》的方法，对筛选得到的高效降解菌进行生理生化试验鉴定，包括葡萄糖发酵、乳糖发酵、蔗糖发酵、山梨醇发酵、淀粉水解明胶液化、MR、过氧化氢酶、V-P、柠檬酸盐利用、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原和吲哚试验。

3、分子鉴定。试剂盒提取目的菌株总DNA，16SrDNA特异性引物进行扩增，引物序列为：P16SL：5'-GAGA-GTTTGATCCTGGCTCAG-3';P16SR：5'-GCCCCCGT-CAATTCCTTTGAG-3'。PCR反应条件为：95℃预变性5min;95℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环;72℃延伸10min。PCR产物切胶测序。

测序后的16SrDNA序列在NCBI中Blast比对同源性。选择同源关系较近的序列，采用MEGA7进行聚类分析，构建系统发育树。

二、结果与分析

（一）高效降解菌的分离

以毒死蜱为唯一碳源，从受污染的农田土壤样品中筛选出57株降解毒死蜱的菌株。纯化后梯度增加毒死蜱浓度至1000mg·L^-1，分离到1株具有高耐药性的降解菌株，编号为B19。

（二）降解效率的测定

采用紫外分光光度法测定标准浓度毒死蜱，以毒死蜱浓度为横坐标（x），毒死蜱在292nm的吸光值为纵坐标（y），绘制毒死蜱的标准曲线（见图1），得线性回归方程为：y=0.0154x+0.0579，R²=0.9991，结果显示在0～200mg·L^-1毒死蜱浓度范围内有良好的线性关系，此线性方程可以用来计算样品中毒死蜱的浓度。

将筛选出的高效降解菌株种子液以10%的接种量接种于100mg·L^-1的毒死蜱无机盐液体培养基中，在37℃、120r·min^-1培养72h，利用石油醚萃取后用紫外分光光度计测量OD292，以计算降解率。菌株B19在100mg·L^-1毒死蜱中培养72h对毒死蜱的降解效率为52.34%。

（三）菌株的鉴定

1、菌株的形态。通过形态学观察，对菌株B19形态特征（见图2a、图2b）进行描述，结果如下：菌落在LB培养基上为圆形或近圆形，呈皱褶状，干燥（见图2a）。制成装片在显微镜下观察为革兰氏染色阳性菌，杆状，末端圆（见图2b）。

2、菌株的生理生化特征。对菌株B19进行生理生化试验，特征见表1。结合生理生化特征，将该菌初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

3、分子学鉴定。

（1） PCR扩增。提取菌株B19的基因组DNA作为模板，以16SrDNA的特异性引物进行扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，120v电压电泳40min，出现900bp左右的条带，切胶测序见图3。

（2）测序结果分析。将菌株B19的16S rDNA核苷酸序列在NCBI中进行Blast比对，结果表明，菌株B19与枯草芽孢杆菌的同源性高达99%，说明该菌株在分子系统发育分类学上属于枯草芽孢杆菌，学名为Bacillus subtilis。对该序列用MEGA7软件中的邻接法进行聚类分析（见图4），可以看出其与枯草芽孢杆菌同源性最高，归为同一支。综合形态学及生理生化特征分析，将菌株B19鉴定为枯草芽孢杆菌。

三、结论与讨论

毒死蜱作为我国有机磷农药中广泛使用的农药之一，其残留问题已引起农药界的极大关注。李文华从苹果园中分离到三株对毒死蜱具有高效降解能力的降解细菌HP-1、HP-2和HP-3，将其分别鉴定为人苍白杆菌，硝基还原假单胞菌：微嗜酸寡养单胞菌。在pH7.2和28℃条件下培养7d，细菌HP-1、HP-2和HP-3对100mg·L^-1的毒死蜱降解率分别可以达到50.6%、59.5%和45.6%。张群等测定了一株从污染淤泥中分离的高效降解菌寡氧单孢菌对100mg·L^-1毒死蜱4d的降解效率约为60%。

本研究从常年施用毒死蜱农药的农田土壤中筛选出1株能以毒死蜱为唯一碳源和能源的高效降解菌B19，该菌株最高能够耐受1000mg·L^-1浓度的毒死蜱，对浓度100mg·L^-1毒死蜱72h的降解率为52.34%。结合形态学、生理生化、16SrDNA序列同源性以及聚类分析，将该菌鉴定为枯草芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌作为一种极具研究开发潜力的微生物菌种，具有安全、高效、环保的特点，在环境污染处理中占据着重要地位。范迪等研究发现：添加枯草芽孢杆菌和光合细菌能够显著净化水禽养殖水质，有效改善养殖环境。何芝菲从果园土壤中分离到1株枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），对100mg·L^-1氯氰菊酯120h降解率为30.25%，对氯氰菊酯有明显的降解作用。

本研究筛选出的对有机磷农药具有高效降解能力菌株枯草芽孢杆菌B19，来源于土壤，能够适应土壤环境，可作为有机磷农药微生物降解的优良菌株材料进行下一步研究。

作者简介：齐芬芳（1986-），女，湖南株洲市人，硕士，讲师，研究方向：有机磷农药微生物降解。

（责任编辑 曹雯梅）