绿头鸭TLR7基因序列分析及其在组织中的表达谱1)

李靖 翟博宇 朱晓艺 杜嘉楠 吴晨薇 叶颖萱 文艺 李婧妍 牛鑫鑫 曾祥伟 梁冬莹

(东北林业大学，哈尔滨，150000)

模式识别受体(PRRs)是一类高度保守，主要表达于天然免疫细胞，可以识别一种或多种病原体保守结构分子，即病原体相关分子模式(PAMPs)的识别分子[1]。PRRs是能够快速识别病毒、细菌和真菌等病原体感染，启动天然免疫应答的关键[2]，其包括Toll样受体(TLRs)、视黄酸诱导型基因I样受体(RLRs)、核苷酸结合寡聚化域样受体(NLRs)、C型凝集素受体(CLRs)[3-4]。TLRs是进化上高度保守而古老的PRRs，几乎存在于所有的多细胞生物中[5-6]。其中Toll样受体7(TLR7)主要分布在细胞内的细胞器中，如内质网溶酶体、内体等[7-8]，识别喹啉咪唑派生物、RNA病毒的单链RNA、合成聚尿苷酸RNA、某些小的干扰RNA[9]，在抗病毒的天然免疫中发挥重要作用[10]。目前，哺乳动物的Toll样受体的研究，已经取得了许多突破和进展。但是，与哺乳类TLR7(hTLR7)相比，禽类TLR7(chTLR7)额外多了3个亮氨酸富集重复区(LRR)，致使其识别的配体有所差异[11]；另外，与hTLR7相比，chTLR7的大部分激动剂不能引起I型干扰素的表达上调[12]；这些都表明禽类和哺乳类TLRs之间是有差异的。

在实践中，对于鸟类，尤其是野生鸟类的TLRs还知之甚少。野鸟作为病毒的重要载体，对许多病原体微生物具有较强的耐受能力；很多病毒只是携毒而不表现出明显症状，而且野鸟的迁徙行为更是大大增加了病毒的活动范围和流动性。因此，为了了解TLRs在野鸭先天性免疫中的作用，本研究以绿头鸭(Anasplatyrhynchos)为样本，克隆了TLR7基因，并进行了序列分析和表达谱的测定，为进一步研究野鸭TLR7与机体先天性免疫、抗感染机制、野鸟疾病防控提高参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿头鸭样品来源于国家野生鸟类疾病监测站。总RNA提取试剂、反转录引物(Oligo(dT))、逆转录酶(M-MLV)、重组RNA酶抑制剂、高保真聚合酶、DNA聚合酶、DNA相对分子质量标记、连接酶、T载体克隆试剂盒(pMDTM18)、加脱氧腺嘌呤核糖核苷酸(dA)试剂盒、荧光定量试剂盒、大肠杆菌DH5α均购自大连宝生物(TaKaRa)公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州博日(BioFlux)公司；常规试剂均为国产或进口分析纯产品。

1.2 绿头鸭总RNA提取和cDNA的合成

采集绿头鸭的心、肝、脾、肺、肾、肠试样，进行总RNA提取，将试样各转移至液氮预冷研钵，加入液氮研磨至粉末状；随后采用特里佐尔法(Trizol法)提取RNA，将RNA溶解于20 μL焦碳酸二乙酯水中，并将上述RNA模板(5 μL)加入1 μL反转录引物(Oligo(dT))，70 ℃水浴10 min。冰上急冷2 min，随后将上述样品液加入到含有2 μL 5倍反转录酶缓冲液、3 μL脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、0.5 μL重组RNA酶抑制剂(RRI)、0.5 μL反转录酶(M-MLV)的体系中，旋涡混合后，聚合酶链式反应(PCR)仪42 ℃反应1 h、70 ℃反应15 min，获得的cDNA模板-20 ℃保存备用。剩余样品置于冰箱-80 ℃保存。

1.3 TLR7基因的克隆测序

引物设计：根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库(GenBank)上公布的绿头鸭的TLR7序列，用引物设计软件(Oligo7)设计出特异性全长引物(TLR7-F、TLR7-R)、荧光定量引物(qTLR7-F、qTLR7-R)，β-肌动蛋白-F、β-肌动蛋白-R由文献获得[13](见表1)。

PCR扩增：采用巣式PCR的方法连续扩增2次，2次PCR的反应条件相同，第二次反应的模板为第一次反应的产物。第一次反应以绿头鸭的脾的cDNA为模板，反应体系——2倍高保真酶预混液12.5 μL、TLR7-F 1 μL、TLR7-R 1 μL、双蒸水9 μL、模板2 μL。反应条件——98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2次PCR的反应条件相同。采用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。

目的基因的克隆测序：将绿头鸭TLR7基因的胶回收产物末端进行加脱氧腺嘌呤核糖核苷酸(dA)反应，体系——胶回收产物8 μL、10倍缓冲液1 μL、脱氧腺苷三磷酸(dATP)0.5 μL、加dA的酶0.5 μL。65 ℃水浴10 min，然后将上述产物连接在pUC18构建的高效TA克隆载体(PMD18-T)上，将连接产物转化至感受态细胞中，通过菌落筛选阳性菌落进行菌落PCR，体系——10倍PCR缓冲液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP 1 μL，TLR7-F、TLR7R各1 μL，DNA聚合酶(rTaq)0.25 μL，双蒸水19 μL，细菌液1 μL。PCR循环条件——95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循环30次；72 ℃ 10 min。最后将阳性菌液送至吉林库美生物科技有限公司进行测序。

表1 引物信息

1.4 生物信息学分析方法

使用依据局部比对算法的搜索工具(BLAST)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)分析获得序列的同源性；使用MegAlign软件(DNAstar，USA)进行基于氨基酸序列的序列同源性和系统发育分析；运用蛋白质结构预测工具(SMART)(http：//smart.embl-heidelberg.de)预测基因序列的蛋白质结构域；使用分子进化遗传分析软件(MEGA 7.0.26)构建邻接法(N-J)进化树。

1.5 TLR7在绿头鸭体内的组织表达谱

以上述提取的心、肝、脾、肺、肾、肠cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，以测量TLR7在绿头鸭体内的表达谱，以β-肌动蛋白为内参基因，通过2-ΔΔCt法计算测试组TLR7基因与对照组中β-肌动蛋白的相对表达率；使用引物见表1，每个组织样本设立3个重复孔，反应体系——生物染料法荧光定量试剂(TB Green Premix Ex Taq Ⅱ)5 μL，qTLR7-F、qTLR7-R各0.2 μL，双蒸水3.6 μL，cDNA 1 μL。为了验证引物特异性，通过将样品的温度从55 ℃增加到100 ℃产生产物的解离曲线来判断。

2 结果与分析

对绿头鸭脾cDNA进行巣式PCR后，得到预期的目的条带(见图1)。将菌液PCR得到的阳性样品送测序，对测序结果进行BLAST分析，发现与绿头鸭TLR7(GenBank号：DQ888644)同源性最高(99.84%)，确定扩增序列为TLR7基因，随后将其提交至美国国家生物信息中心(NCBI)，登录号为MK7039600。

绿头鸭TLR7基因的开放式阅读框架(ORF)全长为3 144 bp，编码1047个氨基酸。SMART程序预测蛋白结构域结果显示(见图2)，TLR7具有典型的TLRs结构，由胞内功能区(TIR)、跨膜区、胞外区三部分构成，其中胞外区包含有信号肽序列、富含亮氨酸的重复C末端结构域(LRR-CT)、亮氨酸富集重复区(LRR)，LRR有10个，与已有的研究相同[14]。运用同源性分析软件(Megalign)，将TLR7与其它鸟类(家鸽、鸿雁，以及其它绿头属物种等)、哺乳类(智人、恒河猴、家鼠、褐鼠)、鱼类(鲤鱼、东方鲀)、两栖类(爪蟾)的相关基因序列进行同源性分析，结果发现：TLR7与鸟类同源性最高，均在85%以上，且与其它绿头鸭属的物种相关性在99%以上；其次是哺乳类，同源性在63.2%～68.3%之间；然后是两栖类，同源性在62.2%～62.5%；与鱼类同源性最低，在58.8%～60.0%。绿头鸭TLR7与其它物种的氨基酸序列同源性趋势与基因序列相同，由高到低依次为鸟类(82.2%～100.0%)、哺乳类(62.0%～66.7%)、两栖类(61.0%～62.9%)、鱼类(55.3%～57.6%)。

运用Mega 7中的N-J法构建进化树(见图3)，可明显看到形成4个单独的族簇，同类物种间进化保守。在鸟类中，绿头鸭TLR7与雁形目关系较近，而与鸽及原鸡相差较远。

设脾的相对表达量为1.00，则绿头鸭TLR7 mRNA在不同组织中的表达谱——脾为1.00、肺为0.13、肾为0.12、心为0.08、肝为0.28、肠为0.27，在脾中属最高表达，在肝、肠中属中表达，在肺和心中属较低表达。

3 讨论

当病原微生物入侵机体后，分布在宿主与环境交界面的TLRs能够快速识别和结合病原体的PAMPs，与配体结合后的TLRs发生构象变化，开始募集下游相关的接头分子，触发下游信号通路的级联反应，从而激活免疫相关基因的表达[15-16]。TLR7是TLRs的重要组成部分，主要识别病毒RNA类的PAMPs，如甲型流感病毒[17]，在抗病毒的天然免疫中发挥重要作用[10]。本研究克隆出了野生绿头鸭的TLR7全长，并进行了生物信息学分析，发现其具有典型的TLRs结构，由胞外区、跨膜区、胞内区组成[18]；其基因序列和氨基酸序列与鸟类同源性最高，与哺乳类、两栖类、鱼类形成明显的4个组簇，而同类物种间的进化则十分保守。对鸟类的氨基酸序列分析发现，其胞内区高度保守，氨基酸突变主要集中在胞外区，胞外区的LRR重复序列具有典型的马蹄铁样螺线管结构[19]，负责PAMPs的识别，其空间结构的细微变化都会影响对PAMPs的识别[20]；可见不同鸟类间胞外区的差异，与其对不同病毒的易感性有关。

本研究对绿头鸭的脾、肺、肾、心、肝、肠进行了实时荧光定量PCR(qPCR)测定，发现TLR7在各组织中普遍表达，TLR7在脾中表达最高，其次为肝和肠，最低为肺和心。而四川白鹅和北京鸭，则是在免疫组织和呼吸道中最高表达[14，21]。已有研究报道，H5N1感染后的番鸭中的TLR3的表达在脾和肺中下降[10]、抗性宿主鲤鱼在感染呼长孤病毒后TLR3表达下降[22-23]；此外，还有报道，在慢性感染期间人口腔黏膜中的TLR2/4/5 mRNA均呈现出下调[24]、在慢性结肠炎感染的小鼠中检测到肠道上皮细胞中TLR5表达下降[25]。综上所述，该绿头鸭在野外生活过程中已经携带了相关病毒或者是某种病毒的抗性宿主，从而使肺中TLR7的表达量下降。

综上所述，本研究成功克隆出了绿头鸭TLR7(GenBank号：MK7039600)的全长，并对其进行了生物信息学分析，发现MK7039600具有典型TLRs家族结构特征，在同类物种中进化高度保守。同时，qPCR显示TLR7在测试的组织中普遍分布。从学术角度，需要进一步研究的是TLR7在抗病毒反应中的动态变化、作用机制，明确TLR7在绿头鸭抗病毒过程中的作用，为野鸟疾病的防控提高参考。