硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的体外药物释放和抗菌性能*

杨小平 隆丽娜 杨英年 梁萍 罗兰 黎锦丽 梁周 庞科 邹崇祺 罗善超*

负载抗生素的PMMA 是治疗慢性骨髓炎的有效局部缓释系统[1-2]。该局部抗生素缓释系统具有以下优势: 在感染部位释放高浓度抗生素，同时消除外科清创后的死腔，并且保持较低水平的血清药物浓度。但是负载抗生素的 PMMA也存在一些缺点，主要缺点之一是在初始阶段抗生素呈爆发释放，然后呈现持续的低于治疗浓度的药物释放[3]。由于负载抗生素PMMA 的不可生物降解性质，长时间的低于治疗药物浓度的抗生素释放可导致局部细菌增殖和生物膜形成，这可能导致耐药细菌的产生和感染的复发[4]。负载抗生素的PMMA 的上述缺点影响了其抗感染效果和在临床实践中的应用。因此，为了应对这一严峻的挑战，研发能够持续释放高于治疗药物浓度，从而提高抗菌作用的缓释系统显得尤为重要。鉴于负载抗生素PMMA 的缺点，负载抗生素的硫酸钙是用于治疗慢性骨髓炎的最有吸引力的可吸收缓释载体之一，它能够消除手术清创后的死腔，在完全降解后可以释放全部抗生素[5]，并且缺乏细菌定植基础。负载抗生素的硫酸钙通过零级动力学和表层降解方式释放抗生素。因此，硫酸钙的抗生素释放相对稳定、持续，并长期处于治疗水平，这可以抑制细菌生长。类似于负载抗生素的 PMMA，负载抗生素的硫酸钙也具有固有的缺点:它不能为骨骼结构提供机械支撑作用，尤其是随着硫酸钙的降解。然而，骨骼结构的机械稳定性在慢性骨髓炎的治疗中具有重要意义[6]。由于其不可降解的特性，负载抗生素的PMMA 可以为骨骼结构提供即时或持续的机械稳定作用或有利于维持骨骼结构稳定。

万古霉素是对革兰氏阳性菌有效的糖肽类抗生素，尤其适用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）所致骨髓炎的治疗[7-8]。在以往的临床研究中，与万古霉素PMMA 比较，万古霉素硫酸钙和万古霉素PMMA构成的硫酸钙/PMMA复合缓释系统能更有效地治疗慢性骨髓炎[9]。然而，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的抗生素释放规律和抗菌性能仍未清楚。因此，本研究的目的是探讨万古霉素硫酸钙和万古霉素PMMA构成的硫酸钙/PMMA复合缓释系统的体外抗生素释放规律和抗菌性能，并且和含万古霉素的PMMA 进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

万古霉素（CAS NO. 1404-93-9; 分子量: 1486; 希腊）。硫酸钙（Stimulan®kit，Biocomposites 公司，英国），PMMA（PALACOS®MV，Heraeus 公司，德国）。金黄色葡萄球菌亚种（CICC®10301，中国工业微生物菌种保藏管理中心）。

1.2 药物缓释系统的制备

根据说明书制备万古霉素硫酸钙颗粒。将5 cc Stimulan®硫酸钙粉剂与1 g 万古霉素粉剂在无菌碗中搅拌混匀，然后加入3 cc 灭菌用水。充分混合直至形成光滑的糊状物（约30 s）。在所提供的模具中涂上均匀的糊状物，使糊状物固化至少15 min，以形成直径为3.0 mm、高度为3.0 mm 的颗粒（见图1A）。在完全固化后弯曲模具释放颗粒。

负载万古霉素PMMA根据以下步骤在无菌条件下制备。将1 小袋40 g PMMA 粉末与2 g 万古霉素粉剂在无菌碗中混合。将单体液体加入上述混合物中。然后，将糊状物涂在柔软的橡胶模具上，制成大小为15.0 mm×15.0 mm×15.0 mm的正方体元件（见图1B）。在完全固化后弯曲模具释放正方体元件。非负载万古霉素PMMA 元件以同样的方式制备。

通过电钻分别在万古霉素PMMA 元件的两个正方形侧面浅层内制造5 个直径为3.0 mm、高度为3.0 mm 的空腔。把万古霉素硫酸钙颗粒植入PMMA 元件表层的空腔内，以制备硫酸钙/PMMA 复合缓释系统（见图1C）。使用环氧乙烷对抗生素缓释系统进行灭菌处理。

图1 A.万古霉素硫酸钙颗粒;B.万古霉素PMMA;C.硫酸钙/PMMA复合缓释系统

1.3 模拟体液（SBF）的制备

将 NaHCO30.355 g，NaCl 8.035 g，K2HPO43H2O 0.231 g，MgCl26H2O 0.311g，KCl 0.25 g，Tris 6.118 g，Na2SO40.072 g，CaCl20.292 g，1.0 M-HCl 39 mL 溶于 1 000 mL 的蒸馏水制备模拟体液，用酸度计测量溶液的pH，用0 ～5 mL 浓度为l M 的HCl 调节溶液的pH 为7.4。

1.4 体外抗生素释放浓度检测

通过高效液相色谱法（HPLC-MS，检测下限为3.125 g/mL）建立万古霉素标准曲线。通过使用具有紫外（UV）检测器（322 nm）和柱（mBondapak，C18，10 mm 125A，3.9 mm×300 mm，Waters 公司，英国）的Agilent HPLC 系统（Agilent 1100）进行HPLC 分析。以三乙胺∶乙腈∶四氢呋喃溶液（92∶7∶1）（pH 3.2）为流动相，流速为1 mL/min，室温下在286 nm 处检测万古霉素·HCl。本研究中采取的峰面积和色谱法经过线性、灵敏度、精密度、准确度和特异性确认。

将硫酸钙/ PMMA 复合缓释系统或万古霉素PMMA 的3 个样本分别浸入含有10 mL SBF（pH 7.4）的无菌聚乙烯容器中，温度为37℃。在样品浸入SBF 溶液后的不同时间点（4 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d 和49 d）进行全量换液。将洗脱液在 4℃下保存用于进行抑菌环试验。根据万古霉素的标准曲线，通过HPLC 测定上述不同时间点样品洗脱液中的万古霉素浓度。

1.5 细菌培养和生长条件

本研究采用的菌种为金黄色葡萄球菌亚种。把细菌接种于营养肉汁琼脂（CM0002，中国工业微生物菌种保藏管理中心），在37℃下培养24 h，然后鉴定为纯培养物用于后续实验。

把生长状态良好的单菌落接种到营养肉汤培养基中并培养48 h，然后用营养肉汤把细菌浓度调整为1×103、1×105、1×108cfu/mL。

1.6 硫酸钙/PMMA 复合释放系统的抑菌环试验

制备直径为6 mm 的滤纸盘，然后用环氧乙烷灭菌。从血琼脂平板中选择3 ～5 个菌落，孵育24 h。使用上述菌落制备细菌悬浮液用于接种。然后将细菌悬浮液的细菌浓度调节至3×108cfu/mL（0.5McFarland）。用无菌棉签吸取细菌悬浮液，并将棉签中过量的细菌悬浮液挤压在培养管壁上。将棉签细菌涂布在整个M-H 琼脂平板的表面上，并将平板每次旋转 90°以确保均匀涂布。将不同时间点（将样品浸入SBF 后的 4 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d 和49 d）提取全量换液的30 L SBF 洗脱液浸渍直径为6 mm 的滤纸盘。将未含万古霉素的PMMA 浸入SBF中，并将提取物用作抑菌环检测的空白对照。把滤纸置于涂有细菌的M-H 琼脂培养皿并在37℃培养24 h。采用游标卡尺测量滤纸盘周围的抑菌环直径。

1.7 统计学方法

除非另有说明，所有数据均以均数±标准差表示。使用SPSS 11.0 软件进行配对 检验（当数据具有相等方差时）和非参数 检验（当数据具有不等方差时），并且<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外抗生素释放试验

如图2、图3 所示，为各检测时间点硫酸钙/PMMA 复合缓释系统以及万古霉素PMMA的万古霉素释放浓度曲线。硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的硫酸钙在7 周内逐渐降解。硫酸钙/PMMA 复合缓释系统和万古霉素 PMMA 释放万古霉素的特征是先快速释放后缓慢释放。在硫酸钙降解期间，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统释放的万古霉素最大浓度在24 h 检测时间点为754.68 g/mL。万古霉素PMMA 释放的万古霉素最大浓度在7 d 检测时间点为57.39 g/mL。在检测的各个时间点，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统释放的万古霉素浓度均高于 PMMA 万古霉素释放的万古霉素浓度（<0.05）。

图2 硫酸钙/PMMA复合缓释系统不同时间点释放的万古霉素浓度

图3 万古霉素PMMA 不同时间点释放的万古霉素浓度

2.2 抗菌性能评价

表1 显示在不同时间点的万古霉素对M-H 琼脂平板上细菌的抑菌环直径。在不同时间点的抑菌环试验中，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的抑菌环直径均大于万古霉素PMMA 的抑菌环直径（见图4）。在该实验中，未观察到非负载万古霉素PMMA 出现抑菌环。

表1 不同释放时间点的万古霉素对M-H琼脂平板上细菌的抑菌环试验（mm）

图4 不同时间点的抑菌环（mm）:A.万古霉素PMMA;B.硫酸钙/PMMA 复合缓释系统

3 讨论

在以往包括临床研究在内的体外和体内研究中，比较了各种形式的硫酸钙和 PMMA，以及其他负载抗生素的局部缓释系统的抗生素缓释和抗菌作用。然而，很少有研究报道由万古霉素硫酸钙和万古霉素PMMA构成的硫酸钙/PMMA复合缓释系统的抗生素释放和抗菌性能。因此，本研究探讨了由万古霉素硫酸钙和万古霉素 PMMA 组成的硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的抗菌素释放规律和抗菌作用，并与万古霉素PMMA 相比较。

与抗生素PMMA 比较，由万古霉素硫酸钙和万古霉素PMMA组成的硫酸钙/PMMA复合缓释系统可能具有以下几个优点，或者它可以发挥协同抗菌作用。

首先，与抗生素 PMMA 相比，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的万古霉素释放更多并且在研究期间获得了持久有效的抗生素浓度。负载抗生素的PMMA 最常用于作为局部抗生素缓释系统治疗慢性骨髓炎，并且传统上用于骨科相关感染的预防和治疗。负载抗生素的PMMA 可以直接在感染部位释放抗生素而提高局部的抗生素浓度。但是，PMMA 骨水泥中抗生素的释放呈现为早期由表层释放抗生素引起的短期爆发性释放[10]，随后持续释放低于治疗浓度水平的药物，并且呈现为抗生素的部分释放（～10%），这可能导致感染和细菌生物膜的形成而不能提供有效的抗菌效果[11-12]。由于抗生素 PMMA 的这些缺点，它已经引发对 PMMA 替代品的研究，以便在感染局部能够获得更持久和更高浓度的抗生素。与抗生素PMMA 比较，可生物降解的抗生素硫酸钙在万古霉素释放方面表现更好，并且抗生素能完全从硫酸钙中释放出来。抗生素硫酸钙的体外释放动力学表现出缓慢持续和局部有效释放。这确保防止抗生素耐药性的出现，抗生素耐药性是由于在治疗浓度下缓慢的残留药物释放导致的。在本研究中，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的硫酸钙在7 周内逐渐降解，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统的万古霉素释放浓度均远高于抗生素PMMA 的万古霉素释放浓度（<0.05）。这可能与硫酸钙的可吸收性质和逐渐降解特性有关。此外，通过在PMMA 表层嵌入硫酸钙颗粒能够保证其可以完全降解及释放抗生素。

其次，与抗生素PMMA 相比，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统能表现出更好的体外抗菌作用，从体外的抑菌环试验结果可以看出，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统在各个时间点都能更有效抑制金黄色葡萄球菌生长，差异具有统计学意义（<0.05）。抗生素 PMMA 被认为是治疗慢性骨髓炎的标准手段之一，但它有其自身的缺点，主要是它呈现为抗生素爆发式释放和低于治疗水平的释放动力学特征，特别是在释放的抗生素浓度随时间下降的时候[13]。当PMMA的抗生素释放水平低于最小抑制浓度时，PMMA 载体本身可能作为感染的潜在基础，并且可以给细菌的定植和生物膜的形成提供有利条件。细菌生物膜有利于细菌生长[14]，并且能抵抗宿主的免疫攻击[15]，这可能会引起慢性感染的发展和复发。将万古霉素硫酸钙颗粒植入PMMA 的表层可以实现并维持在预期的时间内保留所需的抗生素水平而产生更有效的抗菌作用。

最后，硫酸钙/PMMA 复合缓释系统可能可以产生协同作用。由于其固有的不可生物降解特性，万古霉素 PMMA可长时间消除外科清创术后的空腔并提供结构稳定作用，这可能有利于骨髓炎的治疗和控制后的骨重建。抗生素硫酸钙可以提供有效的局部抗生素浓度[16]，但它也有自身的缺点。硫酸钙的吸收可以在体内快速发生，并且材料的机械强度会随着降解而迅速丧失，因而不能提供有效的机械结构支撑和保持骨骼结构完整的作用。在硫酸钙/PMMA 复合缓释系统治疗骨髓炎的时候，随着硫酸钙颗粒的降解在感染局部能够达到更高水平和更持续有效的抗菌素浓度。然后，PMMA在提供局部抗生素的同时可提供结构支撑作用强度和保持骨缺损区的结构完整性。

在本研究中，与万古霉素PMMA 比较，硫酸钙/PMMA复合缓释系统在检测的各个时间点都能够释放更高浓度的抗生素（<0.05）, 并且在体外可更有效地抑制细菌生长（<0.05）。对该系统进一步研究将有利于其在控制骨科感染中的应用。