MiR-1207-3p靶向XRCC6对结直肠癌细胞HT-29凋亡的影响

宋 韬，周 颖，吴煌福，何贵省

在全球癌症发病率和死亡率排名中，结直肠癌分别排名第3位和第4位[1]。每年有超过100万新的结直肠癌病例和约70万人死于结直肠癌[2]。结直肠癌的发生和发展涉及多种因素，包括癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是长度约为19～24 nt的内源性非编码小RNA，通过靶向靶基因mRNA的3′端非编码区(3′ untranslated region, 3′-UTR)引起转录抑制或调节mRNA[4]。MiR-1207-3p通过纤维连接蛋白调节前列腺癌中的雄激素受体[5]。X射线修复交叉补充因子6(X-ray repair cross complementing 6,XRCC6)参与DNA双链断裂修复和重组。XRCC6抑制吉西他滨诱导的DNA损伤和多种癌细胞凋亡[6-7]。然而，miR-1207-3p在结直肠癌中的作用未见报道。基于此，本研究旨在探讨miR-1207-3p靶向XRCC6对结直肠癌细胞HT-29凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 XRCC6,Cleaved-Casp3,Cleaved-Casp9,TUBULIN抗体(英国Abcam公司；货号：ab233237,ab2302,ab2324,ab32124)；HT-29细胞(上海恒斐生物科技有限公司；货号：SCC-110711)；RPMI-1640培养基(美国GE Healthcare公司；货号：SH30091)；胎牛血清(美国Thermo Fisher Scientific公司；货号：10099-133)；蛋白酶抑制剂Cocktail(不含EDTA,mini片剂)(美国Bimake公司；货号：B14011)；PBS[生工生物工程(上海)股份有限公司；货号：E607008]；青链霉素混合液(100×)(北京索莱宝科技有限公司；货号：P1400)；2×SDS蛋白电泳上样缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；货号：WB-0081)；蛋白裂解液(碧云天生物技术有限公司；货号：P0013)；LipoFiter3转染试剂[汉恒生物科技(上海)有限公司；货号：HB-LF3-1000～HB-LF3-3000]；p3mirGLO质粒(优宝生物公司；货号：VT1439)；Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒[齐一生物科技(上海)有限公司；货号：K801-200]；miR-1207-3p序列来自miRBase(http://www.mirbase.org/)，miR-1207-3p mimics和miR-1207-3p inhibitor由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miR-1207-3p SYBR Green miRNA实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)试剂盒(哈尔滨海基生物科技有限公司；货号：AP02720)；miRNA cDNA第一链合成试剂盒(上海康朗生物科技有限公司；货号：KL-F363)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 结直肠癌细胞HT-29维持在含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10%热灭活的胎牛血清的RPMI-1640培养基中，且处于潮湿37 ℃ 5% CO2培养箱中培养。通过LipoFiter3转染试剂转染结直肠癌细胞HT-29，将miR-1207-3p mimics或miR-1207-3p inhibitor与脂质体混合，静止约20 min后，缓缓滴入HT-29细胞。

1.2.2 Western Blot 进行10%或12%SDS-PAGE的电泳，然后转移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔径)。将PVDF膜在室温下含有0.01%Tween-20和5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5,150 mmol/L NaCl)中封闭1 h，然后在4 ℃下与目的蛋白的抗体(XRCC6,Cleaved-Casp3,Cleaved-Casp9,TUBULIN)温育过夜，然后将膜在室温下与缀合有HRP的相应二抗孵育1 h，观察特定蛋白质使用ECL Plus Western印迹检测系统。

1.2.3 qRT-PCR 将结直肠癌细胞HT-29用细胞刮刮下，装入1.5 mL的EP管中，用PBS洗3次。使用miRNA快速提取试剂盒抽取MCF7的miRNA。使用miRNA反转录试剂盒将纯化好的总miRNA进行逆转录。用miR-1207-3p的正向和反向引物进行qRT-PCR。MiR-1207-3p上游引物序列为5′-TCAGCTGGCCCTCATTTC-3′，下游引物序列为5′-GAAATGAGGGCCAGCTGA-3′。内参U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。将来自逆转录反应的1 μL cDNA加入到含有10 μL 2×SYBR Green和0.2 μmol正向和反向引物的20 μL qRT-PCR混合物中。PCR在ABI 7500实时PCR系统中进行。预变性阶段：95 ℃下孵育10 min；循环反应阶段：95 ℃下孵育10 s，60 ℃下孵育30 s，共循环40次；溶解曲线阶段：95 ℃下孵育15 s，60 ℃下孵育60 s，95 ℃下孵育15 s。将所有样品标准化为人U6并表达为倍数诱导。实验重复3次。

1.2.4 Annexin V染色 在Annexin V染色之前，将结直肠癌细胞HT-29置于37 ℃ 5% CO2和1%O2的缺氧室中16～18 h;将结直肠癌细胞HT-29在低氧或含氧量正常的条件下培养2 h，然后在指定的氧条件下用1 μm阿糖胞苷处理16～18 h。之后使用Annexin V-FITC-A染色，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 MiR-1207-3p与XRCC6的相关性在线分析 根据TargetScan生物软件在线分析，发现miR-1207-3p与XRCC6的3’UTR有1处高度匹配，处于16～22的位置，图1。将XRCC6的3’UTR做UC非匹配突变，将其与野生型XRCC6的3’UTR克隆进pmirGLO双荧光素酶报告载体。通过luciferase assay，与对照组比较，MT-XRCC6 3′UTR报告活性降低(t=14.73，P<0.000 1)，图2。

图1 TargetScan生物软件在线分析miR-1207-3p与XRCC6相关性

图2 利用双荧光素酶报告系统检测miR-1207-3p靶向XRCC6基因

2.2 过表达miR-1207-3p后XRCC6蛋白和HT-29细胞凋亡标志蛋白的表达量变化情况 为了阐明miR-1207-3p靶向XRCC6与HT-29细胞凋亡的相关性，转染miR-1207-3p mimics进HT-29细胞。qRT-PCR检测结果显示miR-1207-3p的相对表达量显著增加(t=17.73,P<0.000 1)。裂解HT-29细胞后，Western Blot检测结果显示XRCC6的表达量下降，细胞凋亡标志蛋白Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表达量上升。Annexin-V染色结果显示HT-29细胞凋亡水平上升(t=34.18,P<0.000 1)。图3、图4和图5。

图3 转染miR-1207-3p mimcs后miR-1207-3p的表达水平

图4 过表达miR-1207-3p时XRCC6和凋亡相关蛋白表达水平

图5 过表达miR-1207-3p时HT-29细胞凋亡水平

2.3 敲低miR-1207-3p后XRCC6蛋白表达量和HT-29细胞凋亡水平变化情况 为了进一步阐明miR-1207-3p靶向XRCC6与HT-29细胞凋亡的相关性，转染miR-1207-3p inhibitor进HT-29细胞。qRT-PCR检测结果显示miR-1207-3p的相对表达量明显减少(t=12.95，P<0.000 1)；裂解HT-29细胞后，Western Blot检测结果显示XRCC6的表达量上升，细胞凋亡标志蛋白Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表达量下降；Annexin-V染色结果显示HT-29细胞凋亡水平下降(t=3.375，P=0.027 9)。图6、图7和图8。

图6 转染miR-1207-3p inhibitor后miR-1207-3p的表达水平

图7 敲低miR-1207-3p时XRCC6和凋亡相关蛋白表达水平

图8 敲低miR-1207-3p时HT-29细胞凋亡水平

3 讨论

肿瘤本质上是多基因疾病，其中细胞逃脱正常生长控制机制，经历自主增殖，变得侵入性，并且由于一种或多种原癌基因的激活或肿瘤抑制基因的突变或缺失而显示恶性表型[8]。癌症的发展有许多调节因子[9-10]，这些调节因子可以调节癌基因或肿瘤抑制基因的表达，从而在肿瘤促进或抑制中发挥作用[11-12]。

已发现miRNA通过调节信号分子(如细胞因子、转录因子、生长因子、促凋亡和抗凋亡基因)的表达来调节细胞增殖、分化和凋亡，表明miRNA与肿瘤的发生、发展和预后密切相关[13]。本研究通过TargetScan分析，发现miR-1207-3p能够靶向结合XRCC6的3′UTR的16-22的区域。MiR-1207-3p由位于8q24易感基因位点的PVT1非蛋白编码基因编码[14]。Das等[5]发现miR-1207-3p的过表达显著诱导细胞凋亡，并显著抑制前列腺癌细胞的增殖；提示miR-1207-3p的促凋亡作用可能广泛存在于多种细胞中。本研究发现过表达miR-1207-3p时，结直肠癌细胞HT-29凋亡水平上升(P<0.05)；敲低miR-1207-3p时，结直肠癌细胞HT-29凋亡水平下降(P<0.05)。MiR-1207-3p在多种癌症中低表达，包括结直肠癌[15]，提示miR-1207-3p是一种潜在的抑癌因子。本研究发现过表达miR-1207-3p时，XRCC6的表达量下降，细胞凋亡标志蛋白Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表达量显著上升(P<0.05)，细胞凋亡水平上升(P<0.05)；敲低miR-1207-3p时，XRCC6的表达量上升，细胞凋亡标志蛋白Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表达量显著下降(P<0.05)，细胞凋亡水平下降(P<0.05)。在正常细胞中，Bax与XRCC6蛋白C-末端的相互作用已被证明可通过将其与线粒体隔离来抑制细胞凋亡[16]，提示miR-1207-3p所致的XRCC6表达量下降造成了XRCC6-Bax复合体的减少，游离Bax的增多，最终导致Bax进入线粒体引发了细胞凋亡。XRCC6通过C-末端接头结构域中赖氨酸残基的乙酰化进行转录后调节，导致Bax的释放。XRCC6的乙酰化受组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶的调节，2组相反的酶主要参与染色质重塑[17]。本研究发现了一种基于转录水平对XRCC6表达量的调节引发的细胞凋亡，而非基于对XRCC6进行蛋白质翻译后修饰的调节。

综上所述，miR-1207-3p可通过抑制XRCC6表达量来促进结直肠癌细胞HT-29的凋亡。