基于FGF23-Klotho轴探讨肾元颗粒对db/db糖尿病肾病小鼠骨骼的保护作用＊

朱国双，王 岚，，邹新蓉，吴文静，，孙 龙，邓丹芳，王小琴＊＊

（1.湖北中医药大学中医临床学院 武汉 430061；2.湖北省中医院 武汉 430061；3.湖北省中医药研究院 武汉 430061）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的主要微血管并发症之一，是导致骨质流失的主要病因之一，也是患者进展为终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）的首要因素[1]。随着病情的进展，DKD可出现明显的钙磷代谢紊乱，并导致破骨细胞（osteoclast，OC）的活性和相关破骨蛋白表达增加，骨细胞活性降低，新骨形成减少，骨保护素的表达减少，骨质流失增加等一系列骨质代谢紊乱性疾病。因而，预防和治疗DKD患者骨质的流失，是目前亟需解决的问题。

Klotho作为抗衰老基因，主要表达于肾脏中，可与骨分泌的FGF23结合，参与体内的钙磷代谢。前期研究发现[2-4]，肾元颗粒可改善链脲佐菌素（STZ）诱导的DKD小鼠的肾功能，增加肾脏Klotho蛋白的表达，减少血FGF23的含量。同时在5∕6肾切除的慢性肾脏病（CKD）大鼠模型中[5]，肾元颗粒具有保护骨骼，上调OPG蛋白表达的作用。为进一步探索FGF23-Klotho轴在骨骼中的具体作用机制，本文采用db∕db糖尿病肾病小鼠进行研究，通过观察小鼠骨质流失情况，以及FGF23、Klotho蛋白表达水平，探讨其对骨骼的保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级7周龄db∕db雄鼠30只（许可证号：SCXK（苏）-2015-0001；合格证号：32002100006025），同周龄同窝野生型（wild type，WT）小鼠10只（许可证号：SCXK（苏）-2015-0001；合格证号：32002100006026），购于南京大学-南京生物医药研究院。并饲养于湖北中医药大学SPF级屏障环境动物房。

1.2 材料

肾元颗粒（湖北省中医院院内制剂），购于湖北省中医院，批号：20190906；厄贝沙坦，购于湖北省中医院，赛诺菲（杭州）制药有限公司，批号：8A421。高磷饲料（含磷1.2%、钙1.6%），购自北京博泰宏达生物科技有限公司。试剂：FGF23 ELISA试剂购于Bio-Swamp（货号：MU30742）；ALP试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司（货号：A059-2）；钙测试盒购于南京建成生物工程研究所有限公司（货号：C004-2）；兔抗小鼠一抗Klotho购于美国sigma公司（货号：SAB3500604）；小鼠抗小鼠一抗FGFR1购于英国abcam公司（货号：ab824）；兔抗小鼠一抗Osteoprotegerin购于英国abcam公司（货号：ab9986）；FITC标记的驴抗兔二抗、Cy3标记的羊抗小鼠二抗购于塞维尔生物技术有限公司（货号：GB21301、GB22403）；HRP标记山羊抗小鼠二抗购于塞维尔生物技术有限公司（货号：GB23301）。

1.3 仪器

全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技）；TGL-16M型高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机设备有限公司）；SpectraMax®M2型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；DYY-5D型电泳仪，Trans-Blot型SD转膜仪，GelDoc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；全自动研磨仪（武汉赛维尔生物）；石蜡切片机（德国Leica公司）；组织包埋机（天津天利航空机电有限公司）；激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica公司）。

1.4 方法

1.4.1 db/db小鼠糖尿病肾病模型

适应性喂养1周后，对小鼠进行尾静脉采血，测量随机血糖。连续3次随机静脉血糖≥随机静脉16.7 mmol·L-1，尿量大于空白组150%，确定糖尿病造模成功。

1.4.2 动物分组及给药

将30只db∕db小鼠随机分为3组：模型组、肾元颗粒组、厄贝沙坦组，10只WT小鼠作为正常组；肾元颗粒组按6.0 g·kg-1灌胃肾元颗粒配制的药液，厄贝沙坦组按30 mg·kg-1沙坦组-1灌胃厄贝沙坦片配制的药液，3组给药容积均为20 mL·kg-1，各组连续给药12周。

1.4.3 标本采集

腹腔麻醉，行摘眼球取血，取血完成后，置于4，低速冷冻离心机中离心，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存。采血完成后，打开小鼠腹腔，摘取小鼠双侧肾脏，小心剔除包膜，将右侧肾脏置于4%多聚甲醛中固定，另一侧立即进行液氮速冻，随即转存于-80℃冰箱中待测。取下小鼠双侧胫骨，将肌肉筋膜剔除干净，右侧放入4%多聚甲醛中固定；另一侧进行液氮速冻，随即转存于-80℃冰箱中待测。

1.4.4 血清FGF23和骨钙盐、ALP活性检测

将冻存的小鼠血清从-80℃冰箱中取出，冰上解冻分装冻存的血清，参照小鼠FGF23试剂盒说明，准备样品和标准品，酶标孔中加入100μL标准品和样品，进行3个复孔，盖上封板膜37℃孵化2 h。小心揭开封板膜，弃去孔内液体，吸水滤纸上拍干。添加100μL生物标记抗体，盖上新的封板膜，37℃孵化1小时。弃去孔内的液体，加入洗涤液200μL，静置2 min并甩干，重复3次后弃去液体。每孔加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min。每孔加入终止液50μL，终止反应。以空白孔调零，450 nm波长测量每孔的吸光度（OD值）。

将小鼠胫骨从-80℃冰箱中取出，冰上解冻后，进行胫骨组织研磨匀浆，离心取上清液。具体操作参照钙试剂盒。在空白孔中加入10μL去离子水，标准孔中加入1 mmol·L-1钙标准液10μL，测定孔中加入10μL样本液，最后在三者中加入250μL工作液Ⅰ，混匀混匀静置5 min后，波长610 nm测定每孔的OD值。

小鼠胫骨ALP测定，参照ALP测试盒说明书，在空白孔中加入双蒸水5μL，标准孔中加入0.1 mg·mL-1酚标准应用液5μL，测定孔中加入待测样本5μL；同时在空白孔、标准孔、测定孔中依次加入缓冲液50μL和基质液50μL，充分混匀37℃水浴15 min后，在各组中加入显色液150μL，混匀后，波长520 nm，酶标仪测定各孔OD值。

1.4.5 Western blot检测

将小鼠胫骨从-80℃冰箱中取出称重，称取的组织放入液氮预冷的研钵中研磨匀浆，按1∶5的比例加入蛋白裂解液，摇床4℃裂解过夜，4℃12000 r·min-1低温离心30 min，取上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，每管蛋白50μg，分装后，-80℃冻存待用。制备分离胶，灌注分离胶，加1 cm的水层，前后震动胶板使胶板水平，室温静置60 min，待分离胶凝固后，配置浓缩胶，去掉水层，灌注浓缩胶，插入梳子，室温静置60 min。待浓缩胶完全固定后，在电泳槽中加入电泳液，将凝胶放入电泳槽中，拿掉梳子。取出样本蛋白和Marker水浴煮沸5 min使蛋白发生变性，样本蛋白上样，电泳电压90 V，待进入分离胶后转为110 V。裁剪PCDF膜5.5 cm×5.5 cm，甲醇充分浸透，海绵垫、滤纸Transfer buffer浸透，取出分离胶，按阴极-海绵-滤纸-分离胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极顺序排列，放入电转槽中，50 V转模1.5h。取出PVDF膜，TTBS漂洗，按目的蛋白的大小进行裁膜并做好标记，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h。配置一抗稀释液，将条带放入一抗稀释液中，4℃冰箱摇床过夜，TTBS清洗10 min三次，二抗室温孵育2 h。TTBS洗膜10 min，滴加A、B发光液（按1∶1比例混合），BIO-RAD凝胶电泳图像分析仪曝光、显影成像，运用Image J进行定量分析。

1.4.6 免疫荧光双标检测

将固定好的肾脏，进行石蜡包埋切片，放入2%双氧水中10 min，室温漂洗10 min，含0.3%Triton X-100室温漂洗破膜，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，血清封闭，分别加入一抗，4，过夜后加入荧光二抗，室温避光孵育1 h，用含有DA磷的封片剂封片，激光共聚焦下观察并拍照。每张切片任选不重复的3个视野，计数双标细胞数，取平均值作为测量值。

1.4.7 统计学方法

采用Graphpad prism 6和SPSS20.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以（xˉ±计）表示，采单因素方差分析比较各组之间统计学差异，P＜0.05表示两组差异存在统计学意义。

表1 各组小鼠生化指标比较

图1 各组小鼠骨钙盐含量

2 结果

2.1 各组小鼠生化指标结果

小鼠生化指标结果（表1）：与正常组比，模型组血磷明显升高，血钙降低，且两组差异具有统计学意义（P＜0.05），表明db∕db小鼠伴发的肾脏损伤可导致体内的钙磷代谢的紊乱。肾元颗粒组血磷降低、血钙明显升高，与模型组比，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明通过肾元颗粒干预，小鼠体内钙磷代谢可得到改善。在厄贝沙坦干预组中，小鼠血磷、血钙与模型组比，两组差异无统计学意义（P＞0.05），表明厄贝沙坦并不能改善db∕db小鼠钙磷代谢；且肾元颗粒与厄贝沙坦相比，肾元颗粒具有优化钙磷代谢的作用。

2.2 小鼠骨钙盐检测结果

骨钙盐结果提示（图1），模型组骨钙含量低于WT组，与WT组比，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明db∕db糖尿病肾病小鼠存在骨钙的流失。肾元颗粒组小鼠骨钙流失减少，与模型组比，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明肾元颗粒具有保护骨钙流失的作用；厄贝沙坦组小鼠骨钙盐流失与模型组比，差异无统计学意义（P＞0.05），表明厄贝沙坦对小鼠骨骼钙盐代谢无调节作用；肾元颗粒组与厄贝沙坦组比，两者差异有统计学差异（P=0.014＜0.05），表明肾元颗粒对骨钙盐代谢调节作用，优于厄贝沙坦组。

图2 各组小鼠ALP活性检测结果

图3 各组小鼠血清FGF23含量结果

2.3 各组小鼠骨骼ALP活性检测

ALP活性结果提示（图2），与WT组比，模型组骨骼ALP活性明显降低，差异存在统计学意义（P＜0.05），表明db∕db糖尿病肾病小鼠存在骨骼ALP的活性降低。与模型组比，肾元颗粒可增加骨骼中ALP的活性，两组差异存在统计学意义（P＜0.05）；而厄贝沙坦组用药后与模型组比，两者差异无统计学意义（P＞0.05），这表明厄贝沙坦对于小鼠的ALP活性没有明显的影响；肾元颗粒组与厄贝沙坦组比，两者差异有统计学意义（P＜0.05），这表明肾元颗粒增加ALP活性要优于厄贝沙坦。

2.4 各组小鼠血FGF23含量

FGF23含量结果提示（图3），模型组小鼠血FGF23含量明显升高，与WT组比，差异有统计学意义（P＜0.05），表明db∕db小鼠伴发的肾脏损伤，可导致体内FGF23的急剧升高；给予肾元颗粒和厄贝沙坦后，两组小鼠血FGF23含量明显减少，与模型组比，差异存在统计学意义（P＜0.05），表明肾元颗粒和厄贝沙坦均能有效的降低血FGF23含量；而与厄贝沙坦组比，肾元颗粒组小鼠血FGF23降低程度优于厄贝沙坦组，且两组差异存在统计学意义（P＜0.05），表明肾元颗粒在改善db∕db糖尿病肾病小鼠血FGF23含量水平上优于厄贝沙坦。

2.5 各组小鼠骨骼OPG含量结果

各组小鼠OPG结果提示（图4），模型组小鼠骨骼OPG蛋白表达明显降低，与WT组比，差异有统计学意义（P＜0.05），这表明db∕db糖尿病肾病小鼠存在OPG表达的丢失；与模型组比，肾元颗粒组小鼠OPG蛋白表达升高，两组差异具有统计学意义（P＜0.05），这表明肾元颗粒可增加db∕db小鼠骨骼中骨保护素的表达；模型组与厄贝沙坦组比，两者差异有统计学意义（P＜0.05），表明厄贝沙坦能上调OPG蛋白的含量；而肾元颗粒组与厄贝沙坦组比，两者差异具有统计学意义（P＜0.05），表明肾元颗粒上调OPG蛋白表达优于厄贝沙坦。

图4 各组小鼠骨骼OPG蛋白含量结果

图5 Klotho和FGFR1免疫荧光激光共聚焦扫描结果

2.6 各组小鼠免疫荧光激光共聚焦扫描结果

免疫荧光双标结果显示，WT组小鼠可观察到完整的肾单位，Klotho集中表达于肾小管上皮细胞中，且分布均匀；模型组肾单位破损最为严重，Klotho表达较少；肾元颗粒组肾单位破损最轻，Klotho表达较多；厄贝沙坦组次之（图5）。

在对阳性细胞表达数的结果中发现，WT组阳性细胞表达数最多，其与模型组比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比，肾元颗粒组和厄贝沙坦组阳性细胞表达数均有显著的增加，且差异存在统计学意义（P＜0.05）；与厄贝沙坦组比，肾元颗粒组小鼠肾脏阳性细胞表达数优于厄贝沙坦组，且差异存在统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

db∕db小鼠属于自发性2型糖尿病模型，该小鼠模型属于4号染色体的瘦素受体（Leptin receptor）基因发生突变所致，下丘脑对饱感物质（瘦素）缺乏反应，不能产生饱感，进食增多，体内合成代谢明显大于分解代谢，引起脂肪的堆积而肥胖，而随着病情的进展，出现不同程度的肾脏损伤，诱发DKD[6]。

DKD属于中医“消渴病”范畴；消渴日久，肾体受损，伤阴耗气，气阴两虚，气虚血运无力，出现瘀血、痰浊、热毒等病理产物的产生。肾体受损，肾精不足，骨髓生化乏源，骨骼失去充养，导致骨质的流失。肾元颗粒（原名：肾安颗粒）是根据邵招娣教授多年致力于DKD治疗和研究的新药[7]。以补肾健脾，通腑泄浊为治疗原则，配伍黄芪、淫羊藿和大黄组成肾元颗粒。肾元颗粒方中以黄芪为君，取其补气升阳、托毒生肌、利水除湿之功；淫羊藿为臣，取其温肾健脾、强筋壮骨之效；加之酒制大黄为佐使，化瘀解毒、通腑泄浊。三药合用，可达标本兼治之功。

FGF23-Klotho轴是调控钙磷代谢的主要激素，协同调控血钙磷吸收、尿钙磷重吸收与排泄、骨钙磷沉积与释放，共同维持机体内的钙磷代谢平衡。Klotho主要表达于肾小管上皮细胞中，具有抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡、抗纤维化、抗肿瘤等多种生物学效应[8-9]。在肾远端小管，Klotho蛋白可与FGFR1相结合，形成Klotho∕FGFR1复合受体[10-11]，并特异性的与FGF23结合，增加FGF23与FGFR1之间的亲和力，形成FGF23∕FGFR1∕Klotho三元复合物，激活早期生长反应因子1（Egr1），抑制1，羟化酶活性表达，增加24-羟化酶活性的表达，减少活性维生素D的合成，使其降解增加，减少磷在小肠中的重吸收[12-13]。在近端小管，FGF23-Klotho轴的激活可抑制肾小管上皮细胞中钠磷协同转运子2a（NaPi2a）和钠磷协同转运自2c（NaPi2c）表达的，减少肾小管对磷的重吸收，增加尿磷的排泄[14-17]，调节体内钙磷代谢的平衡。

钙、磷为骨矿物质盐的主要成分，参与和调节骨硬度的构成。体内99%的钙以羟磷灰石结晶的方式储存于骨组织中，剩余1%钙存储于体液和软组织中。而体内的磷，86%以磷酸钙形式存储于骨组织中，剩余14%磷则存储于细胞中。可见，骨组织是钙磷储存的重要场所，是维持体内钙磷平衡的重要器官[18]。通过检测骨骼和血清中钙磷的含量，可从直接的角度和间接的角度反应骨质流失的情况。

骨组织骨量及内在的生物力学性能等指标是骨性能判定的重要指标[19]。骨量的减少以及骨质内部结构的改变均能影响骨生物力学，可降低生物力学强度。现代药理学研究表明，OPG作为肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成员，其在骨质流失过程发生中有重要意义[20]。OPG与其配体OPGL结合后，可抑制破骨细胞前体细胞分化和诱导破骨细胞生成的关键因子表达，抑制成熟破骨细胞的活性。

此次实验发现，肾元颗粒可明显降低血清中异常升高的FGF23含量，并能明显增加肾脏中Klotho和FGFR1阳性细胞数的表达，使得体内FGF23-Klotho轴得到恢复。随着该轴功能得到恢复，db∕db小鼠体内的钙磷代谢也得到明显改善。通过血磷和血钙水平的观察发现，肾元颗粒能明显降低血磷，增加血钙含量，改善体内钙磷代谢。而这一作用也间接反应肾元颗粒对骨骼的保护作用。为进一步观察肾元颗粒对骨骼的保护作用，此次实验通过检测骨组织中ALP活性、骨钙盐含量以及OPG蛋白的表达情况，直接观察骨组织中成骨细胞的活动和骨骼骨量、骨质流失的情况[21-22]。此次实验结果发现，肾元颗粒可增加骨组织中骨钙盐的含量，上调骨组织中ALP的活性，增加骨骼中OPG蛋白的表达，这表明肾元颗粒具有抑制骨质流失，增加成骨细胞活动，最终达到骨骼保护作用。

综上所述，FGF23-Klotho轴交通着肾脏与骨骼，并将两者联系在一起，这与中医“骨肾同源”理论相合。肾藏精为肾脏的基本生理功能，其所藏之精可充养骨髓，与骨同出一源。通过对FGF23-Klotho轴的研究，有助于从分子生物学角度理解“骨肾同源”的中医基础理论，同时也为揭示中医“肾-精-髓-骨”关联理论的科学内涵和价值提供了有力的证据支持，为DKD的治疗提供新的思路。