MLST和PFGE在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌医院感染监测中的应用

贺文芳，周 柯，周 磊，刘家云，马越云，闫 沛，徐修礼，郝晓柯

(空军军医大学西京医院 1. 检验科 全军临床检验医学研究所； 2. 护理部；陕西 西安 710032)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)属于人体正常菌群，也是条件致病菌，其引起的社区获得性和医院获得性感染逐年增加，特别是高毒力肺炎克雷伯菌和多重耐药肺炎克雷伯菌的传播，给临床治疗带来极大的困难[1]。临床重症感染患者的不断增加，碳青霉烯类抗生素的广泛使用，使得耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)菌株检出呈逐年增多的趋势。CRKP具有在医院广泛传播的潜在风险，其引发的临床感染病死率较高，治疗药物有限，给患者、医院和社会带来极大的影响和危害[2]。多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是两种最常用于细菌分型的分子生物学方法，可用于分析医院分离CRKP的基因型和同源性，从切断感染途径方面入手指导、控制多重耐药菌的传播。本研究收集某医院重症监护病房(ICU)4个月内连续检出的10株CRKP，进行抗菌药物敏感性试验和碳青霉烯酶基因检测，并应用MLST和PFGE方法进行菌株同源性分析，发现其传播规律和流行特点，为医院感染暴发的有效预防提供防控依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集2017年9—12月某三甲医院ICU连续检出的CRKP。

1.2 主要仪器试剂 VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统、GN革兰阴性菌鉴定卡片、AST-GN13革兰阴性菌药敏卡片(法国Biomerieux)，GeneXpert分子诊断系统、XpertCarba-R碳青霉烯酶基因检测试剂盒(美国Cepheid)，抗菌药物药敏纸片(英国Oxoid)，血琼脂培养基、M-H培养基(郑州安图生物)，质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705和ATCC BAA1706(国家微生物菌种保藏中心)。聚合酶链式反应(PCR)扩增仪、凝胶电泳成像系统、CHEF MapperXa脉冲场凝胶电泳系统(美国Bio-Rad)，限制性内切酶XbaI(中国TaKaRa)，Gel Red核酸染料(美国Biotium)。

1.3 抗菌药物敏感性试验 采用VITEK 2 Compact系统和配套的细菌鉴定卡片、药敏卡片进行鉴定以及相应的药敏试验，检测抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)，采用K-B法补充检测部分药物敏感试验。药敏结果依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)药敏试验2019年 M100-29th标准判断结果。

1.4 碳青霉烯酶检测 根据CLSI M100-29th肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测方法进行mCIM试验和eCIM试验，采用赛沛XpertCarba-R试剂盒检测blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48和blaIMP 5个碳青霉烯酶基因。

1.5 多位点序列分型(MLST) 采用煮沸法提取细菌DNA，PCR扩增rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB 7个管家基因，引物参考Pasteur数据库。PCR条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、50℃ 1 min、72℃ 30 s共35个循环，72℃ 5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定为单一条带后，送上海生工生物公司测序。将管家基因的序列在Pasteur数据库(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb. pl?db =pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page =sequenceQuery)进行比对，获得管家基因型别，将7个管家基因型别组合获得菌株ST型别。

1.6 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析 参考美国疾病控制与预防中心(CDC)PulseNet提供的PFGE相关标准化操作程序，调整相关电泳条件，试验方法如下：用比浊仪调整细菌悬液浓度，达4.2～4.5麦氏浊度单位；加入1% Seakem Gold：1% SDS胶，混匀制备胶块；用含蛋白酶K的细胞裂解液CLB在54℃水浴摇床中强力震荡(170～180 r/min)消化2 h；用无菌纯水洗涤胶块2次，TE缓冲液洗涤胶块3次；加入20U XbaⅠ限制性内切酶按比例配制酶切反应体系，37℃水浴孵育6～8 h后，电泳仪中进行脉冲场电泳；电泳参数为电场强度6 V/cm，夹角120度，初始脉冲为6 s，最终脉冲为36 s，电泳时间19 h；电泳结束后，使用Gel Red核酸染料染色，在美国Bio-Rad凝胶成像系统中成像保存图片。

1.7 数据处理 应用BioNumerics软件进行数据分析，选择Diec相关系数和UPGMA方法。

2 结果

2.1 一般资料 共收集ICU CRKP菌株10株，分别标为1、2、3…10号菌株，其中1～8、10号菌株分离自5例(分别标为A、B、C、D、E)患者的临床感染标本，9号菌株分离自病房气压治疗仪面板。5例患者均为男性，年龄28～55岁，平均(46.2±11.3)岁；患者A、C、D痰标本，患者B血、引流液标本，以及患者E血、分泌物标本中各分离1株CRKP菌株，患者E痰标本中先后分离2株CRKP。同期ICU医生、护士的手，治疗车、监护仪、微量泵、血气分析仪、床栏、床头柜、门把手，以及护士长使用的电脑键盘等32个部位环境监测标本中均未分离出CRKP菌株。

2.2 药敏结果 10株CRKP菌株对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和碳青霉烯类抗菌药物均呈高水平耐药；6～8号及10号CRKP菌株对四环素类抗生素敏感，其余1～5号及9号CRKP菌株对包括替加环素在内的四环素类呈高水平耐药。1～5号及9号CRKP菌株具有相同的耐药表型，而6～8号及10号CRKP菌株具有相同的耐药表型。见表1。

表1 10株CRKP菌株对抗菌药物的敏感结果

注：R为耐药；S为敏感。

2.3 碳青霉烯酶检测结果 10株CRKP菌株mCIM试验均阳性，eCIM试验均阴性。经赛沛XpertCarba-R试剂盒检测，均检出blaKPC碳青霉烯酶基因。

2.4 MLST结果 CRKP 7个管家基因的PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证结果如图1所示。PCR测序结果经DNAMAN比对、拼接，得到的序列上传到Pasteur中KPNMLST数据库进行比对分析，10株CRKP均为ST 11型。

2.5 PFGE分型结果 10株CRKP菌株经XbaI酶剪切， PFGE后得到5种带型。其中2～5号及9号CRKP菌株电泳带型完全一致，结合MLST均为ST 11型，考虑为同一来源，为流行菌株。1号CRKP菌株与流行菌株仅有1条条带的差异，两者亲缘关系接近。患者E标本中分离的6～8号和10号CRKP菌株有三种带型，与流行菌株条带相差3条以上，来自痰的6号和与来自血的10号菌株带型相同，但与同来自于痰的7号菌株带型不同。见图2。

M：分子量标准；条带1～7：依次为rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB基因。

图1 CRKP管家基因PCR扩增结果验证

Figure 1 PCR amplification results of CRKP house-keeping genes

图2 10株CRKP PFGE及聚类图

3 讨论

2018年CHINET细菌耐药监测网报道，在呼吸道分离的病原菌中，肺炎克雷伯菌已经超过鲍曼不动杆菌，跃居第一位，其在血等无菌体液的分离率也逐渐升高，仅次于大肠埃希菌，位于第二[3]。CRKP的分离率也居高不下，一项来自中国的多中心研究报道，在所有耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)分离株中，CRKP占73.9%，耐碳青霉烯类大肠埃希菌(16.6%)和阴沟肠杆菌(7.1%)次之；在所有住院患者中，CRE感染导致的病死率高达33.5%，而CRKP在血流感染和下呼吸道感染致死率则更高[4-5]。CRKP感染主要与肺炎克雷伯菌定植或感染病史、肠外营养，使用第三代头孢菌素或碳青霉烯类抗生素有关[6]。

CRKP致死率高的原因之一是对抗菌药物广泛耐药，文献[4, 7]报道CRKP对头孢菌素类、喹诺酮类耐药率高达85%以上，对氨基糖苷类的耐药率较低，但也高达50%以上，而对革兰阴性菌感染治疗最后防线替加环素的敏感率仅有40.2%。本研究10株CRKP菌株中，6株对测试的所有抗菌药物均耐药。替加环素K-B纸片扩散法的抑菌圈仅有7 mm，表现为高水平耐药。CRKP对碳青霉烯类耐药的重要机制为产KPC酶，与国内研究[8]一致，其对替加环素耐药机制可能与外排泵表达上调等有关[9-10]。

国内流行的CRKP主要为产KPC酶的ST 11型[11-12]，与本研究结果一致。但是不同医院CRKP的流行基因型不尽相同[13-14]，研究CRKP的基因型别及同源性有助于监测医院感染及其发生路径，能为切断感染路径，控制医院感染提供依据。MLST和PFGE均可以用作细菌分型，且各有优劣。前者分辨率高，重复性好，数据可共享，可进行不同实验室间比对，但是测序成本高，分析缺少基因组详细信息或含有大量基因组岛插入序列，不能单独作为暴发溯源的工具；后者结果稳定，重复性好，可发现大片段的插入、缺失、重组等，酶切位点的点突变以及质粒的获得、丢失，但操作时间长，受人为影响因素大，分析的是条带而不是序列[15]，通常推荐将二者结合起来进行同源性分析。

本研究中分离10株CRKP菌株的MLST均为ST 11型，未表现出菌株间差异；而通过PFGE分型得到5种带型，其中11月22—28日分离的4株(2～5号)菌株带型与12月6日于气压治疗仪面板分离的CRKP(9号)完全一致。经调查该仪器为科室共用设备，考虑本事件为气压治疗仪为媒介的接触传播导致的医院感染，该结论也表明在研究医院感染阐明菌株同源性时PFGE是MLST的有力补充。2号和3号CRKP菌株分别分离自同一重症胰腺炎患者的腹腔引流液和血标本，其PFGE带型完全一致，推测CRKP可能通过腹腔感染入血；6～8号和10号CRKP菌株分别分离自另一患者的痰、痰、引流液和血标本，只有6号与10号菌株带型完全相同，推测CRKP是通过呼吸道感染入血，同样分离自痰的6号菌株与7号菌株同源性在85%以上，可能为变异株，而分离自分泌物的8号菌株带型差异大，亲缘关系较远。以上两组数据均表明 PFGE在明确细菌感染路径方面的优势。值得注意的是分离自9月16日的1号菌株与本次医院感染流行株的克隆仅差异一条条带，Tenove等[16]认为由于细菌具有变异性，在PFGE图谱分析中，相似值在0.85以上的菌株可以判定为流行病学相关，由此可见本次流行菌株可能为1号菌株变异而来。

综上所述，PFGE在明确医院感染细菌传播路径，个体细菌感染路径以及遗传变异方面具有重要应用价值。杜小莉等[17]也认为PFGE在甄别暴发菌株、高度相关菌株和不相关菌株时有很好的甄别能力，并且分型结果与菌株分离病区、分离时间具有一致性。针对暴发流行菌株，PFGE能够将相同MLST型别的菌株聚成一簇。此外，本研究也从科室环境、患者自身等多个角度发现，采取有效消毒隔离措施的重要性，尤其是患者共用设备，更需严格消毒管理，通过切断感染路径即可有效控制医院感染的发生。