藿香正气汤抑制新型冠状病毒复制过程的有效成分及机制初探＊

杜海涛，王 平，马青云，李 娜，丁 洁，孙铁锋，王从安，王丹丹，张会敏，张丽美

（1.山东中医药大学药学院 济南 250355；2.山东省中医药研究院 济南 250014；3.天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室 天津 300072；4.山东第一医科大学附属颈肩腰腿痛医院 济南 250062；5.山东省医药生物技术研究中心 山东第一医科大学（山东省医学科学院） 济南 250062）

新型冠状病毒（SARS-COV-2）属于β属新型冠状病毒，2019年12月于武汉华南海鲜市场首次被发现并迅速蔓延，可通过空气传播和接触传播，感染后可引起咳嗽、发热、呼吸困难等症状，甚至发展为严重急性呼吸综合征、肾衰竭甚至死亡[1-2]。截止2020年2月19日，已有近八万例感染，两千余例死亡，给世界人民的生命健康带来了极大的威胁。新型冠状病毒肺炎（COVID-19）发病具有典型的湿毒致病特点，属于中医“疫病”范畴，表现为湿困脾闭肺，肺失宣降，气郁身热，患者多有舌苔白腻，大便稀溏，病程比一般呼吸道感染疾病更长，极易耗气伤阴，因此宜用化湿方辅以治疗。

藿香正气汤出自《疡医大全》卷九，是温中化浊的代表方，具有解表化湿、理气和中之功效，适用于湿热之邪积聚内阻导致气机壅塞之症。系列中成药藿香正气口服液、藿香正气水等是《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中表现为乏力伴肠胃不适者的推荐用药，现已在抗疫一线初显成效[3-6]，但这些良方通过什么作用机制达到的疗效目前尚不清晰。传统中药复方通过多成分、多靶点对人体起到全方位的调控作用，因此本研究从分子调控出发，运用分子对接及网络药理学方法，寻找藿香正气汤防控COVID-19的直接及间接作用机制，确定在机体网络中重要靶标，为藿香正气系列方在抗疫战中更好的应用打下基础。

1 材料和方法

1.1 配体准备

从中药系统药理学分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com)中，检索藿香正气汤中白术、陈皮、半夏、桔梗、砂仁、藿香、紫苏、白芷、甘草、白茯苓、厚朴的成分[7]。根据化合物在体内吸收、分布、代谢和排泄（ADME）的药代动力学原理，以口服生物利用度(OB)≥30、类药性(DL)≥0.18作为筛选标准[8]，下载符合筛选标准化合物的*.mol2格式文件，选用瑞德西韦作为对照药。将文件导入Schrodinger11.9，使用“Ligprep”套件进行配体的预处理，包括互生成不同构象和使用Epik在pH 7.0±2.0下的电离态，添加氢原子，中和带电基团，优化配体的几何构型。

1.2 蛋白处理

从上海科技大学饶子和/杨海涛课题组获取目标蛋白3CLpro（PDBID:6LU7）的高分辨（2.1Å，0.21 nm）X射线晶体学结构。在进行分子对接之前，使用Schrodinger中的“Protein Preparation Wizard”套件来预处理原始结构：向蛋白质中添加氢原子，调整键序以及删除5Å以上的水分子。由于3CLpro为共结晶结构，因此使用配体结合位点来定义蛋白质的活性位点。

1.3 分子对接

使用glide（基于网格的具有能量学的配体对接）算法，对制备的大分子和配体进行超精对接。配体的结构保持柔性以产生不同的构象，OPLS力场用于执行对接计算。所有过程在Intel®Core™i7-9750 CPU@2.60 GHz,with 24 GB RAM,Windows 10 Enterprise operating system下进行。

1.4 化合物的网络药理学分析

将打分优于阳性药的化合物结构上传至SwissTargetPrediction数据库，基于2D/3D结构相似性预测化合物在体内的靶点，选取probability＞0的靶点[9]。将预测靶点上传至String服务器，生成蛋白相互作 用 关 系（Protein-Protein interaction,PPI），使 用Cytoscape 3.7.1可视化构建网络，使用Network Analyzer插件分析网络，并将度值＞0的节点定义为Hub节点并做进一步拓扑分析[10]。Hub节点蛋白经UniProt平台转为UniProt ID导入DAVID 6.8平台进行基因本体论（Gene Ontology，GO）分析与京都基因与基因组百科全 书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

表1 各成分药获得化合物数目

图1 3CLpro的高分辨结构

2 结果

2.1 配体与蛋白预处理

经ADME参数筛选后的藿香正气汤各药符合要求的化合物数目如表1所示。去除重复化合物后累计得到183个化合物纳入对接研究。经预处理在LigPrep中共生成了1894种小分子构象。处理后的3CLpro如图1，此蛋白共有1条链，使用红色表示α螺旋部分，蓝色表示β折叠部分，灰色表示无规则卷曲部分，蛋白表面为灰色半透明，红色空腔位置为配体对接活性位点。

2.2 分子对接打分

对照药瑞德西韦分子对接得分-8.243，比对照药瑞德西韦结合好的化合物有5个，对接得分如表2，对接得分是综合了氢键、卤素键、盐桥等非共价键，π-π叠加、π-阳离子等π相互作用，接触力等给出的综合得分，值越小，说明化合物与靶蛋白的结合能力越强[11-12]。细节图见图2，C1-1～CD-1为3D对接模式，C1-2～CD-2为2D对接模式,CD为对照药瑞德西韦的对接模式。

表2 分子对接打分表

2.3 网络药理学分析

2.3.1 靶点预测及PPI分析

在 Swiss Target Prediction平台共预测到Probability＞0的靶点329个。在String平台设置最小相互作用分值为0.7，并隐藏网络中孤立节点，生成的PPI网络共包含168个节点，706条边，使用Cytoscape 3.7.1可视化构建网络，并使用Network Analyzer插件分析。使用度值（Degrees）描述节点在网络中的重要性，定义为该节点与其他相互作用的节点的个数，该网络平均度值8.405。将大于平均度值的节点做进一步拓扑，所得PPI网络有76个节点，454条边，网络中面积越大同时颜色越趋于暖色的节点相对更重要，如图3。

2.3.2 基因富集分析

将PPI中涉及76个蛋白名转为Uniprot ID，输入DAVID 6.8平台进行富集分析，设置物种为Homo sapiens，选择富集蛋白数量前十位且P＜0.05的项目进行可视化，GO富集分析结果见图4，KEGG富集分析结果见图5。由此可知，BP与凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化、蛋白质自动磷酸化、信号转导、细胞增殖的正调控、G蛋白偶联受体信号通路、血小板活化、肽基-丝氨酸磷酸化、细胞分裂、有丝分裂细胞周期的G2/M转变有关；CC与质膜、胞浆、核、胞质、膜、核质、质膜整体成分、胞外间隙、线粒体、中心体相关；MF与蛋白结合、ATP结合、蛋白激酶活性、激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白激酶结合、相同蛋白结合、蛋白酪氨酸激酶活性、酶结合、蛋白质异二聚活性相关。KEGG通路显示，藿香正气汤抗病毒有效化合物通过癌症途径、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白多糖、RAS信号通路、细胞周期、病毒致癌等信号通路发挥作用。

图3 PPI拓扑分析结果

图4 GO富集分析结果

图5 KEGG富集分析结果

3 讨论

目前，除对症支持治疗之外，临床还未批准针对COVID-19的特效药。瑞德西韦的相关报道较多，其不能被nsp14外显子切除，表明具有较强的体外抗病毒活性，在美国已有一例治愈病例[13-14]。但瑞德西韦在人体内抗SARS-COV-2的有效性和安全性尚未得到证实，在临床使用中仍需谨慎。

本研究以抗病毒有效方藿香正气汤为研究对象，以化学药物瑞德西韦为阳性对照，通过筛选来自方中183种化合物，预测直接抑制SARS-COV-2复制的机制。3CLpro是一种半胱氨酸蛋白酶，是介导复制酶多肽1a和1ab水解的功能蛋白，参与病毒复制和增殖过程[15]。结合抗SARS的经验，3CLpro因其基因具有高度的保守性，且在冠状病毒的复制过程产生RNA依赖性RNA聚 合 酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），因此，可作为药物设计的关键靶标，为抗SARS-COV-2药物的研发提供突破口[16-19]。直接抑制病毒复制过程是中药抗病毒的重要途径之一[20]，从分子对接结果来看，藿香正气汤中5个成分与SARSCOV-2 3CLpro结合较好，得分优于对照药瑞德西韦。其中C2具有抗氧化、清除自由基、抗炎、促进碳水化合物代谢、调节免疫系统等活性[21]。据报道，C2可将感染细胞中的丙型肝炎病毒（HCV）复制降低80%，且刺激24h后原代人肝细胞中ApoB的分泌量表示化合物具有低肝毒性[22]。Silvia Schwarz等[23]发现C4是冠状病毒复制和释放相关的3a离子通道的抑制剂并且能干扰病毒生命周期过程。从化合物结构来看，C1-C5都含有黄酮母核，属黄酮类化合物，现该类化合物已被报导具有广泛的抗菌抗病毒作用，具有进一步开发为3CLpro抑制剂的价值[24]。Seri Jo等[25]通过分子对接及蛋白水解法、色氨酸荧光法验证，发现黄酮类化合物（尤其是黄酮醇类）具有疏水性芳环和亲水性羟基，能与SARS-CoV 3CLpro活性位点完美亲和，并有效阻断3CLpro的活性使其失去原本调控复制的能力。

通过网络药理学富集分析结果可看出，前六条通路多和肿瘤、病毒及细胞过程相关。值得注意的是，其中25个基因富集于PI3K-Akt信号通路。已有多项报道已表明，PI3K-Akt信号通路在SARS-CoV和MERS-CoV的感染过程中起到重要作用，并可能作为抵御冠状病毒的药物靶标[26]。因此，我们推测藿香正气汤在体内可以通过作用于PI3K-Akt信号通路进而影响细胞因子，实现对病毒入侵人体后的干预。有研究表明，病毒可以调节宿主细胞的信号网络使得环境更加适宜自己生存和繁殖，例如，人类乳头瘤病毒（HPV）、粘液瘤病毒能够持续刺激Akt，从而激活mTORC1以启动病毒复制[27-28]。Jason Kindrachuk等[29]发现，Huh7细胞经PI3K/Akt/mTOR的靶向激酶抑制剂处理后显著抑制了MERS-CoV的复制。Tetsuya Mizutani等报道了在感染SARS-CoV的细胞中PI3KAkt信号通路被激活以逃避细胞凋亡过程[30]。PI3K或其下游信号Akt的一些抑制剂可阻断病毒进入和复制过程[31-32]。

从《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中可以看出，临床表现乏力伴肠胃不适者，推荐使用藿香正气相关中成药。藿香正气汤出自《疡医大全》卷九，用于疏风寒、消饮食等暑湿症状。本研究结果也显示，藿香正气汤直接作用的有效化合物C1-C5多出自甘草、陈皮、桔梗，方中这几位药也兼具理气健脾，宣肺利咽等“扶正”功效，即能通过直接抑制病毒复制发挥“驱邪”，也能通过调控PI3K-Akt信号通路发挥“扶正”功效，强自身正气并驱邪外出，双管齐下，使病情好转。

但也应当注意，现在受制于对病毒认识和染病机制的不足，计算机预测方法及数据库数据可靠性等自身局限性的影响，虚拟对接和网络药理学预测可能会存在预测结果与实际不符的情况。针对这个问题，课题组认为我们应结合中医药在防治SARS等方面的经验开展进一步的验证和优化，以便更好服务战疫前线。